白術不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性

曹清華， 杜 瑩， 韋萬麗， 周清娣， 廖莉玲

(1.貴州師范大學化學與材料科學學院，貴州貴陽 550001； 2.悉尼大學化學學院，澳大利亞悉尼 2006)

從中草藥中提取抗氧化活性成分的研究已被國內外學者青睞，開發天然抗氧化劑已經成為研究的熱點[1-2]。白術為菊科植物，其有效活性成分主要有白術內酯類、多糖和揮發油等[3]。目前，已有對白術黃酮、多糖抗氧化活性的研究[4-5]，但是鮮有對白術提取物化學成分含量和抗氧化活性的相關性報道。為了深入研究白術抗氧化活性成分，本研究采用清除2，2′-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基與測定總還原能力的方法，系統地評價白術粗提物不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性，并探討各萃取物的抗氧化能力及其與總多酚、總黃酮、總多糖含量之間的相關性，以期為白術抗氧化活性物質的進一步研究及白術的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白術，由貴州同濟藥業有限公司提供；蕓香苷標準品，分析純，購自貴州迪大科技有限責任公司；二苯基苦味?；诫?，分析純，購自東京化成株式會社；沒食子酸標準品，分析純，購自天津市科密歐化學試劑開發中心；ABTS，分析純，購自上海源葉生物有限公司；其余試劑均為分析純。

分光光度計(L5s型，上海儀電分析儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(RE-52型，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(A200S型，德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備 將白術粉碎后過40目篩，稱取3 000 g白術粉末，用87%甲醇按料液比1 g ∶30 mL混勻，于62 ℃水浴提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，抽濾，于55 ℃真空減壓濃縮至粉末狀，得到粗品。取一定量粗品，用蒸餾水溶解，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，萃取3次，旋干各相溶液，分別得到石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相樣品，按照式(1)計算得率：

C=m1/m2×100%。

(1)

式中：C為得率，%；m1為旋干后各部分的樣品質量，g；m2為起始加入的白術樣品質量，g。

1.2.2 總多酚含量的測定 參照文獻[6]，以沒食子酸為標準品，精確配制濃度為0.05 mg/mL的標準溶液，分別取1、2、3、4、5 mL標準溶液，依次加入2 mL FC試劑(即Folin-Ciocalteu試劑)、7.5 mL 15%碳酸鈉溶液，定容到25 mL容量瓶中，反應時間為50 min，反應溫度為35 ℃，在最大吸收波長770 nm下測定標準系列的吸光度。在同樣條件下測定不同樣品的吸光度，平行測定3次，代入回歸方程，計算白術各溶劑萃取物樣品的總多酚含量。

1.2.3 總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法[7]，以蕓香苷為標準品，精確配制濃度為0.2 mg/mL的標準品溶液，等梯度取不同體積的溶液于 25 mL 容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉，反應6 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min后再加入4.3%氫氧化鈉溶液，定容，搖勻后靜置20 min，在515 nm處測定標準系列的吸光度。在同樣條件下測定不同溶劑萃取物樣品的吸光度，平行測定3次，代入相應的回歸方程，計算白術各溶劑萃取物樣品的總黃酮含量。

1.2.4 總多糖含量測定 采用硫酸苯酚法[8]，以葡萄糖為標準品，精確配制濃度為0.2 mg/mL的標準溶液，等梯度取不同體積的標準溶液于10 mL具塞試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，再迅速加入5 mL濃硫酸，于沸水中反應30 min，冷卻后在490 nm處測定標準系列的吸光度，在此條件下測定不同溶劑萃取物樣品的吸光度，平行測定3次，代入回歸方程，計算白術各溶劑萃取物樣品的總多糖含量。

1.2.5 抗氧化能力測定 (1)清除DPPH自由基能力的測定。測定方法參考文獻[9]，并作適當修改：取一定質量的樣品，用80%甲醇溶解，配制成不同濃度的樣液，分別向10 mL容量瓶中加入2 mL不同濃度的樣液，再加入5 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，最后用80%甲醇定容到10 mL。搖勻后避光反應30 min，在517 nm波長下測定吸光度。平行測定3次，以維生素C作為陽性對照，按式(2)計算清除率，并計算清除DPPH自由基的IC50。

R=[1-(D517 nm(a)-D517 nm(a))/D517nm(c)]×100%。

(2)

式中：R為自由基清除率，%；D517 nm(a)為待測液的吸光度；D517 nm(b)為不加自由基的吸光度；D517 nm(c)為不加樣液的吸光度。

(2)清除ABTS自由基的測定。測定方法參考文獻[10]，并作適當修改：將樣品配制成濃度為0.2 mg/mL的樣液，分別取1、2、3、4、5 mL到10 mL容量瓶中，加入5 mL 0.2 mmol/L ABTS溶液，用無水乙醇定容到10 mL，室溫下反應15 min后，在733 nm處測吸光度，平行測定3次，以維生素C作為陽性對照，清除率按式(2)計算，并求出清除ABTS自由基的IC50。

(3)總還原能力測定。測定方法參考文獻[11]，并作適當修改：取1 mL樣液，加入1 mL 磷酸緩沖鹽溶液(即PBS，濃度為0.1 mol/L，pH值=6.8)、1 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液混勻，于50 ℃水浴30 min。冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后在6 000 r/min下離心10 min，取2 mL上清液，加 3 mL 蒸餾水和1 mL 0.1%氯化鐵溶液，靜置10 min后，在700 nm處測定其吸光度，平行測定3次(吸光度越大，說明樣品的總還原能力越強)。

1.2.6 相關性分析 采用Excel 2007處理數據并作圖，通過SPSS 20.0軟件對清除ABTS自由基、DPPH自由基、總還原能力與總多酚、總黃酮、總多糖含量進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 總黃酮、總多酚和總多糖含量的標準曲線

以吸光度對濃度作圖，得出總多酚含量的回歸方程為y=115.4x+0.030 4，r2=0.999 6，式中：y為D770 nm；x為多酚含量(mg/mL)?？傸S酮的回歸方程為y=11.363x+0.001 9，r2=0.999 9，式中：y為D515 nm；x為總黃酮含量(mg/mL)。總多糖含量的回歸方程為y=0.012 8x+0.038 7，r2=0.999 6，式中：y為D490 nm；x為多糖濃度(mg/mL)。

2.2 白術不同極性溶劑萃取物的總黃酮、總多酚和總多糖含量

由表1可知，不同極性溶劑萃取的得率以水相最高，為(86.53±1.66)%，說明白術粗提取物中水溶性物質比較多，其次是正丁醇相，得率為(6.25±0.21)%，石油醚相的得率最低，為(1.14±0.11)%，表明白術粗提取物中極性較小的物質比較少。各分段部位中乙酸乙酯相中的總多酚含量最高，為(37.54±0.51)%，其次是正丁醇相、三氯甲烷相，總多酚含量分別是(17.64±0.56)%、(13.42±0.88)%，表明白術的粗提取物中多酚類物質屬于中等極性的較多。各分段部位中總黃酮含量以乙酸乙酯相中最高，為(30.53±0.92)%，正丁醇相、三氯甲烷相中的總黃酮含量相差不大，分別為(18.83±0.02)%、(18.14±0.61)%，水相中總黃酮含量最低，為(4.22±0.79)%，表明白術的粗提取物中的黃酮類物質屬于中等極性的較多，在極性大的溶劑中黃酮類物質含量較低。在各分段部位中，水相中的總多糖含量最高，為(22.58±0.34)%，石油醚相中總多糖含量最低，為(1.31±0.13)%。

表1 白術不同極性溶劑萃取物中的總黃酮、總多糖、總多酚含量及得率

2.3 白術不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS自由基能力 由表2、圖1可以看出，白術粗提取物中不同極性溶劑萃取物清除ABTS自由基的效果最佳的是乙酸乙酯相，IC50為(0.021±0.003)mg/mL，濃度較小時，隨著濃度提高，清除率迅速增加，當濃度達到0.06 mg/mL時，清除能力就趨于平緩，清除率超過80%，比維生素C清除能力略低。此外，正丁醇相清除ABTS自由基能力也比較好，IC50為(0.034±0.005)mg/mL，當含量大于0.08 mg/mL時，清除能力變化不大。三氯甲烷相、石油醚相和水相清除ABTS自由基的能力均隨著濃度的增加而增加，IC50分別為(0.048±0.012)、(0.061±0.004)、(0.068±0.006)mg/mL，在相同濃度下，乙酸乙酯相、正丁醇相、三氯甲烷相、石油醚相、水相的清除能力依次減弱。

表2 白術不同極性溶劑萃取物的IC50值

2.3.2 清除DPPH自由基能力 由表2、圖2可以看出，白術不同極性溶劑萃取物清除DPPH能力最強的是乙酸乙酯相，IC50為(0.031±0.005)mg/mL，當濃度達到0.08 mg/mL時，清除DPPH自由基的能力與維生素C的清除能力大致相同。在低濃度下，正丁醇相、三氯甲烷相清除DPPH的能力相差不大，IC50也比較接近，分別為(0.040±0.002)、(0.042±0.001)mg/mL；在高濃度下，正丁醇相的清除效果明顯高于三氯甲烷相。石油醚相、水相清除DPPH自由基的能力相對較弱，隨著濃度的增大，其清除效果增強。三氯甲烷相、水相、石油醚相清除DPPH自由基的差異較小，出現這種結果的原因可能是同一種多酚類物質對不同自由基的清除能力有差異，這與李偉等的報道[12-13]一致。

2.3.3 總還原能力 由圖3可知，白術不同溶劑萃取物總還原能力最好的是乙酸乙酯相，比其他相要好很多，當濃度達到0.10 mg/mL時，與維生素C的總還原能力接近。當濃度為 0.02 mg/mL 時，三氯甲烷相、水相、正丁醇相、石油醚相的總還原能力基本一致，隨著濃度增加，正丁醇相、三氯甲烷相的總還原能力的增加幅度明顯大于石油醚相、水相，總還原能力排序依次是維生素C>乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相。

2.4 總多酚、總黃酮、總多糖含量與抗氧化活性的相關性

由表3可知，清除DPPH自由基與清除ABTS自由基IC50、清除DPPH自由基IC50與總還原能力、清除ABTS自由基IC50與總還原能力測試方法之間的相關系數分別為0.929、-0.871、-0.899，清除ABTS自由基IC50與清除DPPH自由基IC50、總還原能力呈顯著相關(P<0.05)。總多酚含量與清除ABTS自由基IC50呈顯著負相關(r=-0.901，P<0.05)，即總多酚含量越高，IC50越小，清除ABTS自由基能力較強，總多酚含量與清除DPPH自由基IC50呈中等相關(r=-0.870)，總多酚含量與總還原能力呈極顯著正相關(r=1.000，P<0.01)，即總多酚含量越高，總還原能力越強。總黃酮含量與清除ABTS自由基的IC50呈顯著負相關(r=-0.912，P<0.05)，總黃酮含量與清除DPPH自由基的IC50呈極顯著負相關(r=-0.976，P<0.01)，總黃酮含量與總還原能力呈顯著正相關(r=0.913，P<0.05)?？偠嗵呛颗c清除ABTS自由基的IC50呈中等正相關(r=0.836)，總多糖含量與清除DPPH自由基的IC50呈顯著正相關(r=0.913，P<0.05)，即總多糖含量越高，IC50越大，清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力越小，總多糖含量與總還原能力呈負相關(r=-0.676)。

表3 總多酚含量、總黃酮含量、總多糖含量、清除ABTS IC50、清除DPPH IC50、總還原能力間的相關性

綜上所述，白術不同極性溶劑萃取物中的總多酚、總黃酮含量排序為乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相，說明白術多酚、黃酮主要為中等極性物質，各萃取物中總多糖含量排序為水相>正丁醇相>乙酸乙酯相>三氯甲烷相>石油醚相。各萃取物清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力及總還原能力的排序均為維生素C>乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相，表明各極性部位的抗氧化能力排序為乙酸乙酯相>正丁醇>三氯甲烷>石油醚>水相，與樣品中總黃酮、總多酚的含量排序相同，存在顯著相關性，而總多糖含量越高，樣品清除ABTS、DPPH自由基的能力越弱，說明黃酮類、多酚類可能是白術的主要抗氧化物質，多糖不是白術的主要抗氧化物質。

3 結論

本研究應用清除DPPH自由基、ABTS自由基法與總還原力法對白術不同極性溶劑萃取物的抗氧化能力進行了系統評價。結果表明，白術不同極性溶劑萃取物清除ABTS自由基、DPPH自由基能力與總還原能力的排序相同。乙酸乙酯相清除ABTS自由基、DPPH自由基的效果最好，IC50分別為(0.021±0.003)、(0.031±0.005)mg/mL，總還原能力也最強，同時，乙酸乙酯相中總多酚、總黃酮含量最高，分別是(37.54±0.51)%、(30.53±0.92)%。其他萃取物的總黃酮、總多酚含量與抗氧化活性強弱排序一致，總多酚、總黃酮含量與清除自由基能力呈負相關，與總還原能力呈顯著或極顯著正相關，而總多糖含量與清除自由基能力呈正相關，提取物中黃酮類、多酚類可能是主要抗氧化物質，可以通過進一步的分離提純活性較好、多酚黃酮含量高的乙酸乙酯相、正丁醇相，得到抗氧化活性物質。

本研究綜合評價了白術提物不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性，并探討了抗氧化能力與總多酚、總黃酮和多糖含量之間的相關關系，可以為白術抗氧化活性物質的分離研究提供科學依據。