重組艾塞那RP—HPLC法肽圖分析

吳宏斌+邱文娜+李磊+熊吉濱

[摘要]目的建立并驗(yàn)證胰蛋白酶裂解-反向高效液相色譜法進(jìn)行重組艾塞那肽肽圖分析研究。方法將重組艾塞那肽樣品用胰蛋白酶水解，酶解所得的肽段通過(guò)反相高效液相色譜法進(jìn)行分析，采用cs色譜柱，以0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液為流動(dòng)相A，以0.1%TFA的乙腈溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫70min，得到重組艾塞那肽肽圖，以此進(jìn)行方法的專(zhuān)屬性、重現(xiàn)性、定量限、批間同一性研究。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)室制備的重組艾塞那肽可以通過(guò)胰蛋白酶裂解RP—HPLC法進(jìn)行肽圖分析，專(zhuān)屬性、重現(xiàn)性均滿(mǎn)足要求，定量限為0.125mg/mL，三個(gè)批次間的肽圖譜也完全一致。結(jié)論表明此方法簡(jiǎn)便可靠、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，驗(yàn)證研究可行，可用于重組艾塞那肽的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]重組艾塞那肽；肽圖；胰蛋白酶裂解；高效液相色譜；方法研究；質(zhì)量控制

艾塞那肽（Exendin-4）是毒蜥唾液腺中分泌的一種胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類(lèi)似物，為含有39個(gè)氨基酸的多肽。該產(chǎn)品首次由美國(guó)Amylin制藥公司開(kāi)發(fā)合成，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)由瑞典阿斯利康公司進(jìn)口銷(xiāo)售，在臨床中已大量應(yīng)用，降低餐后血糖效果好見(jiàn)效快，主要用于控制血糖，減輕體重，改善胰島素抵抗。目前該藥品無(wú)其他公司生產(chǎn)，且無(wú)藥典收藏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)前期的研發(fā)，自主構(gòu)建載體，利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌體內(nèi)重組表達(dá)艾塞那肽，經(jīng)過(guò)純化、濃縮、凍干等工藝，得到重組艾塞那肽。

目前，控制基因工程藥物一致性的一個(gè)重要手段就是肽圖分析（peptide mapping analysis），肽圖分析技術(shù)靈敏高效的特點(diǎn)使其成為對(duì)基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證的首選方法。該技術(shù)不但可以比較重組與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的差別，還可幫助判別樣品在生產(chǎn)過(guò)程中是否發(fā)生了變化，以驗(yàn)證生產(chǎn)工藝和樣品的穩(wěn)定性，所以肽圖分析也是考察供試品與對(duì)照品之間以及不同批次產(chǎn)品之間同一性的重要手段。本研究采用胰蛋白酶對(duì)重組艾塞那肽進(jìn)行酶解，以RP-HPLC法對(duì)酶解的肽段進(jìn)行分析，與合成艾塞那肽進(jìn)行一致性比對(duì)，并對(duì)3批重組艾塞那肽進(jìn)行了肽圖分析，建立重組艾塞那肽的質(zhì)量控制方法以及驗(yàn)證研究，得到較好的結(jié)果。

1儀器與試劑

1.1儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260）；電子天平（Sartorius BSA224S-CW）；超純水儀（MilliporeMilli-Q）；超聲儀（舒美KQ-300VDV）；真空泵（天津GM-0.50）；水浴鍋（Fisher215）。

1.2試劑材料

乙腈（色譜醇，F(xiàn)isher公司，LOTl36911）；三氟乙酸（分析純，sigma，BCBJ6836V）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸氫銨、醋酸等（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胰蛋白酶（Sigma，LOT#SLBFl700V）；艾塞那肽合成品（上海吉爾生化有限公司，批號(hào)P140218）；重組艾塞那肽（自制，批號(hào)Exl50108、Exl50322、Exl50603）；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)后，確定重組艾塞那肽純度測(cè)定的實(shí)驗(yàn)色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse C。（4.6x250mm，粒徑5μm）；以0.1%三氟乙酸的水溶液為流動(dòng)相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液為流動(dòng)相B液，梯度洗脫70min（A液從100%～30%，B液從0～70%）；流速110mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm；進(jìn)樣量100μL；系統(tǒng)適用性要求滿(mǎn)足。

2.2樣品處理

取樣品使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行溶解，使?jié)舛燃s為1mg/mL，使用1%碳酸氫銨溶液進(jìn)行透析，取2mL透析液，加入400μL經(jīng)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理過(guò)的胰蛋白酶溶液（0.1 mg/mL，溶劑為1%碳酸氫銨溶液），37℃水浴保溫20h后，加入240μL50%醋酸溶液，混勻后用0.45μm濾膜濾過(guò)，取濾過(guò)液進(jìn)樣。

2.3專(zhuān)屬性研究

取重組艾塞那肽、合成艾塞那肽以及空白溶液按照上法同步操作，液相色譜儀上樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1，空白溶液中（A）只有溶劑峰，重組艾塞那肽（C）與合成艾塞那肽（B）酶解后的肽段峰一致。結(jié)果表明使用HPLC法對(duì)艾塞那肽進(jìn)行肽圖分析的專(zhuān)屬性研究滿(mǎn)足要求，使用基因工程技術(shù)表達(dá)出的重組樣品具有與合成樣品一致的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.4重現(xiàn)性研究

員工A取重組艾塞那肽按照上法操作，液相色譜儀上樣，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次（每樣進(jìn)2針）；員工B于另一天同法操作，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次（每樣進(jìn)2針）。記錄色譜圖，選取色譜圖中5個(gè)主峰，計(jì)算峰面積及相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表中數(shù)據(jù)可知，各峰面積及相對(duì)保留時(shí)間CV值均≤2.0%，表明本實(shí)驗(yàn)室樣品重組艾塞那肽適用胰蛋白酶裂解-RP-HPLC法進(jìn)行肽圖分析，并且結(jié)果準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。

2.5定量限

取重組艾塞那肽樣品，按照上法操作，濾過(guò)液使用1%碳酸氫銨溶液倍比稀釋?zhuān)謩e稀釋為原濃度的1/2、1/4、1/8、1/16，取稀釋液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，取5個(gè)主峰為研究對(duì)象。通過(guò)圖譜分析，1/8濃度稀釋液中，5個(gè)主峰中最小峰信噪比為11，滿(mǎn)足藥典方法驗(yàn)證“信噪比≥10：1”的要求，因此本實(shí)驗(yàn)室重組艾塞那肽進(jìn)行肽圖檢查的定量限設(shè)為0.125mg/mL。

2.6批間同一性研究

按上述方法對(duì)連續(xù)3批重組艾塞那肽（批號(hào)為Exl50108、Exl50322、Exl50603）進(jìn)行肽圖分析，各批樣品圖譜一致，分析結(jié)果見(jiàn)圖2。表明本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)大腸桿菌重組的艾塞那肽表達(dá)穩(wěn)定，多肽結(jié)構(gòu)具有一致性，胰蛋白酶裂解RP-HPLC法可用于重組艾塞那肽的鑒別分析和質(zhì)量控制。

3討論

按生物仿制藥上市要求，我國(guó)企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)不低于國(guó)外原研產(chǎn)品，其藥物分子結(jié)構(gòu)應(yīng)與原研產(chǎn)品一致，通過(guò)肽圖分析嚴(yán)格保證每一批次終產(chǎn)物的一致性和安全性，從而有效地控制基因工程藥物的產(chǎn)品質(zhì)量。目前上市艾塞那肽產(chǎn)品是通過(guò)合成的方式獲得，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)基因工程方式制備生物仿制藥，一方面為了摸索重組艾塞那肽的可行性降低成本，另一方面為研究長(zhǎng)效重組GLP-1藥物打下基礎(chǔ)。

3.1方法學(xué)驗(yàn)證

目前藥典法定方法有胰蛋白酶裂解一反向高效液相色譜法和溴化氰裂解法，前者具有更高分辨率及檢測(cè)靈敏度，在蛋白質(zhì)及多肽分離分析中得到廣泛應(yīng)用，因此重組艾塞那肽的肽圖分析采用胰蛋白酶裂解一反向高效液相色譜法。經(jīng)查肽圖檢查作為一項(xiàng)重要的定性分析，很少有關(guān)于其方法學(xué)驗(yàn)證的文章，本實(shí)驗(yàn)在重現(xiàn)性研究中選取了5個(gè)代表性主要峰的出峰時(shí)間和峰面積，計(jì)算變異系數(shù)CV，由于是不同實(shí)驗(yàn)人員之間結(jié)果比較，因此未使用RSD表示。定量限研究中也是取的5個(gè)主峰中最小峰信噪比，峰數(shù)的選擇應(yīng)當(dāng)視肽圖圖譜而定，一般肽圖峰數(shù)少的情況下可以少取，但不應(yīng)少于3個(gè)特征主峰。

3.2實(shí)驗(yàn)條件摸索

為確保重組艾塞那肽在預(yù)處理過(guò)程中的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)將樣品在4℃環(huán)境中進(jìn)行透析，透析后的樣品澄清，未見(jiàn)任何混濁和沉淀現(xiàn)象。在色譜條件摸索過(guò)程中，使用色譜柱c_x和c_lx對(duì)樣品進(jìn)行肽圖分析，圖譜效果相當(dāng)，C_x的分離度更好。通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描，裂解液在214nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，與理論值一致。由于七氟丁酸較為昂貴，本試驗(yàn)選用了三氟乙酸-乙睛-水體系，通過(guò)梯度洗脫可以達(dá)到滿(mǎn)意的分離效果。另外柱溫和流速的改變對(duì)該樣品肽圖的測(cè)定影響不大，因此采用了藥典指導(dǎo)值。

3.3結(jié)果分析

RP-HPLC色譜圖比對(duì)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)重組表達(dá)的艾塞那肽肽圖與合成的對(duì)照品一致，不同批次間的肽圖譜也完全一致。該研究表明本實(shí)驗(yàn)室制備的重組艾塞那肽可以通過(guò)胰蛋白酶裂解-RP-HPLC法進(jìn)行肽圖鑒別，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，并且方法簡(jiǎn)便可靠、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，方法驗(yàn)證研究可行，為該藥物的研發(fā)生產(chǎn)及申報(bào)提供良好的支持和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

在專(zhuān)屬性研究中，重組艾塞那肽比起合成艾塞那肽，在相對(duì)保留時(shí)間28min和32min左右有兩個(gè)小峰。經(jīng)研究重組艾塞那肽的純度在95.4%，低于合成的98.8%，兩峰初步考慮為表達(dá)純化過(guò)程中未能有效去除的雜質(zhì)峰。實(shí)驗(yàn)室下一步將改良純化工藝提高樣品純度，同時(shí)對(duì)相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行分析研究。