核因子E2相關因子2在肺腺癌中的表達及臨床意義

馮穩，張冰，于慶凱[鄭州大學附屬腫瘤醫院（河南省腫瘤醫院）病理科，河南 鄭州 450003]

臨床論著

核因子E2相關因子2在肺腺癌中的表達及臨床意義

馮穩，張冰，于慶凱
[鄭州大學附屬腫瘤醫院（河南省腫瘤醫院）病理科，河南 鄭州 450003]

目的研究核因子E2相關因子2（以下簡稱轉錄因子Nrf2）在肺腺癌組織中的表達及臨床意義。方法收集本院胸外科手術治療的肺腺癌組織標本88例，正常肺組織標本20例，應用免疫組織化學法，檢測組織標本中Nrf2的表達水平。結果Nrf2在正常肺組織中陽性表達率低于10%，在肺腺癌組織中的陽性表達率為69.3%，在有淋巴結轉移的肺腺癌組織中Nrf2的陽性表達率為73.3%。低分化組腺癌組Nrf2陽性表達率（84.6%）明顯高于中分化組（76.4%）和高分化組（70.7%）。結論轉錄因子Nrf2在肺腺癌組織中表達上調，與肺腺癌的組織分化程度、淋巴轉移具有一定的相關性。

肺；腺癌；Nrf2；免疫組織化學

肺腺癌（lung adenocarcinoma）是肺癌的一種，屬于非小細胞癌，是目前臨床常見的肺癌類型，也是非吸煙人群中最常見的肺癌類型[1]。隨著我國工業化進程加快，霧霾等極端惡劣天氣的增多，肺腺癌的發病率逐年增高且呈年輕化趨勢，該病早期癥狀較少、發病迅猛、死亡率高，對患者身體健康造成嚴重影響，如何早期診斷及準確評價腫瘤的分期對于臨床治療具有十分重要的意義。核因子E2相關因子2 （nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）（以下簡稱轉錄因子Nrf2）是近些年新發現的協同刺激分子B7家族成員，具有獨特的生物學功能，它廣泛表達于多種腫瘤組織，卻極少在正常人體組織中表達[2]，該特性對腫瘤的治療及預后具有重要研究價值。因此，本實驗應用免疫組織化學法檢測Nrf2在肺腺癌組織中的表達并研究分析其在肺腺癌診斷及預后判斷方面的臨床意義。

1　材料與方法

1.1標本來源

收集鄭州大學附屬腫瘤醫院 2014年 8月-2015年8月胸外科手術治療的肺癌組織標本88例。其中，男性42例，女性46例；平均（64.31±4.22）歲；低分化13例，中分化34例，高分化41例；所有患者均符合最新肺癌診斷標準[3]，來院前均未接受其他治療。收集正常肺組織20例作為對照，其中女性9例，男性11例；平均（63.42±3.72）歲，無肺系及其他臟器疾病，符合健康人群診斷標準。兩者在性別、年齡方面差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2取材和病理切片的制備

手術切除新鮮肺組織標本后急送病理科，每例患者留取癌組織及癌旁正常肺組織標本各一塊，以甲醛溶液固定24 h以上，制備石蠟包塊，制作連續切片（厚度4μm，德國Leica切片機），分別常規以蘇木素-伊紅（HE）染色、Nrf2免疫組織化學染色，顯微鏡（Olympus公司，BX43，日本）下觀察并拍照。

1.3免疫組織化學染色法

采用Vectastin ABC試劑（VECTOR實驗室，NG EA CLSA），通過生物素-鏈菌卵白素-過氧化酶方法進行，切除的組織標本用甲醛溶液固定，石蠟包埋，組織切片的厚度為4μm，將其置于玻璃片上，用二甲苯脫蠟，在梯度乙醇內水化，在900 w微波加熱2 s，進行抗原修復后，于0.3%的過氧化氫H2O2中浸泡30 min阻斷內源性抗原，用PBS洗3次，用10%正常的血清卵育以阻斷背景非特異性的染色，加上一抗置于濕盒內孵育一夜。一抗為小鼠抗Nrf2（1∶1000稀釋）（Abcam公司，美國）。用PBS洗后，生物素包被的馬抗鼠抗體孵育30 min后用PBS洗3次，再用卵白素連接的過氧化物酶孵育30 min。與二氨基聯苯胺（PAD）孵育后觀察，然后用蘇木素復染。以正常小鼠的IgG代替一抗作為陰性對照組。

1.4Nrf2的表達分析

通過光學顯微鏡分別觀察在胞膜上或和胞漿內計數陽性染色的細胞個數，分析Nrf2的表達情況。在×400倍鏡下隨機選擇5個腫瘤區域進行細胞計數。陽性細胞的密度根據陽性細胞的百分比來進行半定量分級：（-）：表達<10%；（+）：表達10%～ 30%；（++）：表達31%～60%；（+++）：表達61%～80%；（++++）：表達>81%。根據染色情況，將這些標本分為兩組：陰性（<10%）；陽性（10%～100%）。

1.5統計學方法

采用SAS分析軟件包，通過Fisher精確檢驗來分析的Nrf2表達與臨床病理因素之間的關系。P< 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1Nrf2在肺腺癌組織及正常肺組織中的表達

在正常肺組織中，幾乎不表達Nrf2（-）。但是Nrf2在肺腺癌細胞上的表達形式非常彌散，在細胞膜或胞漿內或在兩者內均有表達。在低分化組肺腺癌組織Nrf2陽性表達（++++），顯著高于中分化肺腺癌（+++）、高分化肺腺癌（++）。隨機選擇其中的1次檢測結果見附圖。

附圖　不同肺組織Nrf2免疫組織化學染色結果 （×100）

2.2Nrf2的表達與臨床病理因素的相關性

Nrf2的表達在肺腺癌患者的年齡、性別、有無吸煙史等因素方面差異無統計學意義（P>0.05），而在腺癌的分化程度、TNM分期等方面差異有統計學意義（P<0.05）。組織病理檢查結果發現，Nrf2在20例正常肺組織中陽性表達率低于10%，在88例肺腺癌組織中的陽性表達率為69.5%，在合并有淋巴結轉移的60例肺腺癌組織中Nrf2的陽性表達率為73.3%。低分化組肺腺癌組織Nrf2陽性表達率（84.6%）高于中分化組（76.5%）和高分化組（70.7%），P=0.021。見附表。

附表　不同臨床病理因素影響下Nrf2的表達情況

3　討論

我國每年新增約100萬肺癌患者，80%的病理類型是非小細胞肺癌，其中又以肺腺癌的發病率上升最為明顯，目前約占40%以上[4]，多好發于女性及無吸煙史患者，目前發病率已居世界首位，嚴重威脅人類健康[5-6]。早期診斷是防治此病的關鍵，目前隨著生物技術的發展，針對肺腺癌的檢測手段層出不窮，提高了臨床診斷率。

在腫瘤的發生、發展過程，介導細胞免疫的主要是T淋巴細胞，而在T細胞活化、耐受的免疫調節過程中，B7-CD28家族成員介導的T淋巴細胞共刺激信號傳導途徑起著至關重要的作用，它既可以正性調節增強T細胞免疫應答，也可以負性調節減弱T細胞的免疫應答，對于各種腺癌的治療及預后具有重要的參考價值[7]。NRF2是最新發現的B7-CD28家族一員，人Nrf2位于第9號染色體15q 24.1，由7個外顯子和6個內顯子組成，位于一個具有免疫調節功能的基因座內[8]?？梢酝ㄟ^與靶細胞表面相應受體結合，抑制T細胞免疫應答，發揮負性調控的功能，在癌組織中異常表達，而在正常組織中不表達。本課題研究結果顯示，Nrf2在20例正常肺組織切片中陰性表達，而在88例肺腺癌組織標本中有69.3%的陽性表達率，這表明Nrf2表達升高可以提示腫瘤的發生，可以作為檢測腺癌的一個重要標記物。據近幾年的研究表明，Nrf2分子異常表達于肺癌、膀胱癌等組織內，與腫瘤的預后有相關性[9-10]。Nrf2是一個轉錄因子，并可負性調節T細胞免疫介導的免疫反應，雖然其確切的機制尚不明確，但本課題實驗結果證實在合并有淋巴結轉移的60例肺腺癌組織中Nrf2的陽性表達率為73.3%，在低分化組肺腺癌組織Nrf2陽性表達率為84.6%，顯著高于中分化（76.5%）及高分化組（70.7%）。提示Nrf2表達水平與患者的年齡、性別、有無吸煙等無關，而與腺癌細胞的分化程度、淋巴結轉移相關。根據最新研究[11-13]證實，Nrf2在肺癌、肝癌、胰腺癌中的表達與年齡、性別、腫瘤大小無相關性，而與生存期、腫瘤浸潤程度、腫瘤組織類型相關，另據Zhou等[14]研究表明，Nrf2強表達的肝癌患者發生遠處轉移的時間早，患者生存期短。Sasaki 等[15]研究發現，Nrf2基因突變與肺癌的預后有關。因此筆者推測在肺腺癌的診斷方面Nrf2具有獨特的生物標記價值，有可能會成為評價肺腺癌分期和淋巴結轉移的指標之一。

綜上所述，Nrf2具有獨特的生物學特性，與肺腺癌的組織分化程度、淋巴轉移具有一定的相關性，可以作為肺腺癌疾病診斷及預后的重要參考指標之一，但對Nrf2在腫瘤組織發生、發展過程的作用機制還有待進一步的研究。

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（張蕾編輯）

臨床論著

Expression and clinical significance of Nrf2 in pulmonary adenocarcinoma

Wen Feng，Bing Zhang，Qing-kai Yu
（Cancer Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Henan Provincial Cancer Hospital，Zhengzhou，Henan 450003，China）

Objective To study the expression and clinical significance of signal molecule Nrf2 in pulmonary adenocarcinoma tissues.Methods 88 tissue samples of pulmonary adenocarcinoma and 20 normal lung tissues were collected as research subject.The expressions of Nrf2 in lung tissues were identified by immune histochemistry. Results The positive expression rate of Nrf2 was less than 10%in normal lung tissue，while it was 69.3%in tissue samples of pulmonary adenocarcinoma，and 73.3%in samples combined with metastasis of lymph nodes.The positive expression rate of Nrf2 was higher in poorly differentiated group（84.6%）than that in middle（76.4%）and high differentiation group（70.7%）.Conclusion The expression of Nrf2 was upregulated in tissues of pulmonary adnocarcinoma，and it was related with the degree of differentiation and lymph node metastasis of lung adenocarcinoma.

lung；adenocarcinoma；Nrf2；immune histochemistry

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.006

1005-8982（2016）04-0029-04

2015-09-08

于慶凱，E-mail：yuqingkai@hotmail.com