“Ca2+轉化法”實驗方法補充及基因工程專題的教學建議

胡鵬偉

摘 要：文章以高中生物選修三中“將目的基因導入微生物細胞”實驗方法為例，理清導入方法的不明之處，優化對該步驟的語言表述，并對基因工程板塊內容的教學提出建議，使得該部分內容易于被學生理解，促進核心素養的培養。

關鍵詞：目的基因;導入;基因工程;核心素養

中圖分類號：G633.91 文獻標識碼：A 收稿日期：2019-11-17 文章編號：1674-120X（2020）16-0079-02

高中生物是一門以科學實驗為基礎的技術課程，兼具多種教育功能（如基本科學素養、審美育人功能）。《普通高中生物課程標準（2017年版）》也明確了生物學科素養的重要性。實驗與理論相結合的生物教學能實現教育部現正大力提倡的核心素養目標。“3+1+2”高考新模式在部分省市已然推行，生物選修模塊內容分量也在變重，選修三中基因工程常年考查，數據顯示：近六年基因工程考查分值（51分）在高中生物選修三總體考查中（75分）占到68%。

另外，2017年開始修訂的《考試說明》中對“基因工程的基本原理及技術”內容做出了明確要求，并在修訂的《考試大綱》中明確加入“PCR技術”的內容，可見選修三部分內容的重要性得到了回應，且基因工程也屬生物學前沿知識，在以后的生物信息化教學、信息化發展中也會起到引領作用，其內容重要性不容忽視。

一、“將目的基因導入微生物細胞”實驗方法補充

本部分（高中生物必修三教材第12頁）明確介紹了幾種常用的導入方法：導入植物細胞的農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法;導入動物細胞的顯微注射技術。在導入微生物細胞這方面，教材介紹得不明確。

（一）大腸桿菌轉化的具體方法

關于導入方法，現以2016年浙江模擬題（節選）為例，某課題組進行了下圖的實驗，請回答：圖中導入重組質粒的方法是___，在導入之前應用一定濃度的___處理受體細菌。（答案：Ca2+轉化法? CaCl2溶液）

教材中敘述模糊的問題在對比下就顯現出來：Ca2+轉化法在教材中并未言明，且Ca2+處理法是用于制備大腸桿菌感受態細胞，之后才導入。在一些文獻中，農桿菌感受態細胞也是在Ca2+溶液的處理下得到的，接著可以用來導入外源DNA，以Ca2+轉化法命名稍顯籠統，不像導入動植物細胞的方法那樣具體。筆者查閱大量資料，現總結如下：

1.電擊法轉化大腸桿菌

此方法不需要預先誘導細菌的感受態，原理為：依靠短暫的電擊，促使DNA進入細菌。

細菌經培養生長至對數中期，冷卻、離心后用預冷過的蒸餾水或者緩沖液充分洗凈以降低細胞懸液的離子強度，而后再用含10%甘油的緩沖液懸浮。當細菌受到短時高壓電擊時，DNA可立即被導入感受態細胞。

2.42度熱激法轉化大腸桿菌

與教材中轉化第二步的敘述最接近的便是42度熱激法，也是目前實驗室轉化大腸桿菌的主流方法。其原理為：在0℃條件下，用低滲溶液氯化鈣去處理細菌，菌體細胞在條件變化時會改變形態膨脹成球形，DNA與CaCl2形成羥基-鈣磷酸復合物，黏附于細胞表面（感受態細胞很容易與DNA黏附在一起）。經短時間42度熱激處理，促使細胞吸收DNA復合物，完成導入。

（二）將目的基因導入其他微生物細胞的具體方法

例題：（2012上海高考卷節選）下圖是將人的生長激素基因導入細菌D細胞內，產生“工程菌”的示意圖。所用的運載體為質粒A，生長素合成基因為B，請回答：圖中A和B產生的C叫__，除細菌外，理論上能夠接納C的受體細胞還可以是___。（答案：重組質粒? 酵母菌）

答案表明真菌類也能作為接納C的受體細胞，教材無此內容，在教學實踐中需要補充來適應推陳出新的試題類型，拓寬學生在生物科技專題的知識面。

1.PEG/LiAC（聚乙二醇/醋酸鋰）介導的42度熱激法轉化酵母菌

目前導入酵母菌的主流方法為PEG/LiAC（聚乙二醇/醋酸鋰）介導的42度熱激法。其原理為：用醋酸鋰法制備酵母感受態細胞，增大酵母細胞對外孔隙，然后與重組表達載體在42度水浴加熱下混合共存15min，在PEG/LiAC的幫助下，促進酵母感受態細胞吸收DNA分子。

2.液氮凍融法轉化農桿菌

農桿菌感受態細胞制備方法類似大腸桿菌，用CaCl2法來制備;導入法為液氮凍融法。其原理為：載體DNA分子溶于緩沖液與感受態細胞混合，液氮60s速凍處理，促使細胞吸收DNA復合物。完成導入的農桿菌用于“目的基因導入植物細胞——農桿菌轉化法”當中。

二、對基因工程板塊內容的教學建議

（一）對“將目的基因導入微生物細胞”方法的補充更新

結合以上論證，反觀教材的敘述內容，可做如下補充：

1.微生物受體細胞種類

常用的有大腸桿菌、農桿菌[2]和酵母菌，受體細胞準備環節是化學法制備感受態細胞。制備方法為：大腸桿菌和農桿菌為Ca2+處理法，酵母菌為醋酸鋰處理法。

2.明確導入方法

導入大腸桿菌常用42度熱激法，導入農桿菌為液氮凍融法，導入酵母菌為PEG/LiAC介導的42度熱激法。

（二）重視基因工程板塊知識點更新，以事實為主，體現科學精神

基因工程內容屬前沿知識，變化較快。《中國學生發展核心素養》指出：“要體現科學精神，崇尚真知并具理性思維。”實事求是，探究求真精神必不可少。本板塊重點是學習科技知識和新成果，掌握原理方法，體現核心素養之科學精神。

授課時要指明框架，注重知識更新但不脫離學生實際基礎，拓寬知識面。比如，點明大腸桿菌、農桿菌和酵母菌的導入方法和受體細胞的處理方法;對具體環節原理不加深入，對已明確發展的事實不做模糊化處理。當然，也要照顧到基礎知識的全面性和系統性，且不超綱。

（三）重視基因工程課標考查點，前后實驗知識聯結，助力學生學會學習

教學中要注重前后實驗知識和經驗的聯結。例如，必修一中用顯微鏡觀察多種多樣的細胞，真菌和細菌細胞結構不同，故導入方法各異;探究酵母菌的呼吸方式和酵母菌數量的動態變化，學生對真菌的生存狀態有一定的了解，在選修部分介紹酵母菌的導入，學生不會陌生;特別是學生已經有了選修一微生物實驗的無菌操作以及大腸桿菌的培養等實驗知識基礎，授課時將酵母菌、農桿菌和大腸桿菌的導入知識具體化，也利于深化學生對真菌、細菌等微生物細胞知識的理解。

《中國學生發展核心素養》指出，學生要學會學習，在學習方法和進程等方面要有選擇和調控，勤于反思。本板塊知識聯結前置實驗知識，促成學生學習策略的形成，學會學習。

（四）重視生活與基因工程知識的聯系，培養學生處理信息的能力，體現國家認同與社會責任

中國學生發展核心素養包含國家認同與社會責任，即引導學生認同國民身份和國家現有科技成就。社會責任層面又包含生態意識和責任擔當，即使學生形成可持續發展理念，對未來有責任意識。

生活中，電視、網絡及雜志等媒體都有基因工程新成果的介紹。比如，2016年世界生命科學大會展示的冠鯉，也是轉基因并選育獲得的;2018年1月在頂級生物雜志Cell上的一篇研究報告展示了中國科學家克隆出了第一批非人靈長類動物——食蟹猴，將這些科技進展信息用于教學，可提升學生國家認同感，增強作為公民的歸屬感和榮譽感。

基因工程進展同時帶來諸多問題，如2012年“黃金大米”事件，2016年崔永元與方舟子有關基因工程安全性的論戰;2017中美“百日計劃”中引進美國牛肉等，引發學生多角度思考問題、理智處理問題，引導學生思考基因工程發展對生態環境的負效應及出現的其他的安全問題，引導學生對信息進行多面分析，提高學生處理信息的能力，并培養社會責任意識。

（五）重視該板塊知識與實驗的聯系，培養學生動手能力，體現核心素養之實踐創新

基因工程內容微觀而難以把握，在多數情況下教師以多媒體輔助教學，依然類似“紙上談兵”，動手實踐才能使學生深刻把握，也加強了學生對生物的興趣和提升學生自身的科學素養。中國學生發展核心素養包含實踐創新，主要強調學生在勤于實踐、敢于創新方面的具體表現，提高學生批判質疑和問題解決的能力。

隨著教學和知識的變化，高中階段開設分子實驗是必然趨勢。為幫助學生理解微觀知識內容，建議開展導入大腸桿菌這個環節的實驗課程，準備連接產物、培養基和無菌試驗條件，加之許多學校均有微生物實驗的基礎，可行性較高，能增強學生對基因工程知識的掌握和動手實踐的體驗感悟，達到拓展學生的生物科技視野和增強學生科學意識的目的，為其進一步鉆研生物類專業奠定良好的基礎。[3]

參考文獻：

[1]楊江偉，張 寧，唐 勛，等.生物技術專業基因工程課程教學改革與實踐[J].隴東學院學報，2019，30（5）：113-117.

[2]王鳳歡，馮 瀅，馬旭策，等.農桿菌介導花生胚小葉遺傳轉化體系的優化研究[J].河南農業，2019（17）：23-25.

[3]范思宇.高中生物學任務驅動式教學中情境創設的應用研究[D].呼和浩特：內蒙古師范大學，2019.