從表達載體構建創新看基因工程考題變遷

鄧自發　顧雨薇

摘 要：生命科學發展日新月異，盡管教材內容不會頻繁變動，但秉承著“一核、四層、四翼”的高考試題常常圍繞生物學科新發現、新成就創設情境，設置問題.尤其是基因工程部分，它更為貼近學科前沿.因此，本文結合教材與基因工程技術創新歷程，圍繞基因表達載體的構建分析模考與高考試題的變遷，嘗試為高中生物學教學提供一定的參考.

關鍵詞：基因工程；同源重組；高中生物

中圖分類號：G632 文獻標識碼：A 文章編號：1008-0333（2023）16-0139-04

收稿日期：2023-03-05

作者簡介：鄧自發（1967-），男，陜西省鎮安人，教授，從事生態學研究；

顧雨薇（1996-），女，江蘇省南通人，從事中學生物學課程與教學論研究.

基金項目：江蘇省一流本科專業（生物科學）建設項目；生物科學專業“卓越教師”教學技能培養研究與實踐（南通大學教學改革項目）

基因工程，誕生于20世紀70年代，以它為核心的技術及相關產業一直是研究的熱點.這些年來針對現實不同的需求或是操作，基因工程取得了不少技術創新和優化.現有的教材中介紹的是傳統的表達載體構建，但是通過對以往的高考和模考試題分析，會發現高考的情境從不回避前沿知識.研讀高考評價體系，能清楚發現，在高考評價體系“四翼”的應用性就明確要求高考要多以貼近時代、貼近社會、貼近生活的生活實踐或學習探索問題情境為載體，將陳述性知識與程序性知識的有機整合和運用作為考查目標，體現對即將進入高等學校的學習者遷移課堂所學內容、理論聯系實際水平的測量與評價^[1].所以，在此筆者以基因工程中的核心基因表達載體的構建為主體，通過整理它技術路線的變遷來探究試題變化趨勢.

1 基因表達載體構建技術變遷

1.1 傳統表達載體構建

基因工程又叫重組DNA技術，在現有人教版高中生物教材中介紹的基本工具是限制性內切核酸酶——“分子手術刀”、DNA連接酶——“分子縫合針”、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”.并且后續介紹基因工程的核心構建表達載體時，仍然遵循著最初的思路即利用限制酶和DNA連接酶將目的基因和表達載體相連.因此在傳統的基因表達載體構建中限制酶的選取是基因工程這類題目的考察重點，并圍繞真實科研中遇到的問題設置題目考察學生的科學思維等核心素養.

例題1 （2022·山東模擬）圖1是獲取用于構建基因表達載體的含人生長激素基因的DNA片段（DNA復制子鏈延伸方向是5′→3′，轉錄方向為左→右）示意圖，圖2是所用質粒示意圖，其上的Ampr表示青霉素抗性基因，Tett表示四環素抗性基因.有關限制酶的識別序列和酶切位點見表1.

（1）引物1由5′→3′的堿基序列為，引物2應含有限制酶的識別序列

（2）在構建表達載體的過程中對圖中質粒、DNA片段進行合適的完全酶切后，向兩者的混合物中加入DNA連接酶，若只考慮DNA切段兩兩連接，則混合物中將形成種環狀DNA.答案：AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ 6

解析 分析題目所給的四種限制酶，其中BamH Ⅰ和Bcl Ⅱ屬于同尾酶，它們雖然識別的序列不同，但切出的粘性末端相同.構建基因表達載體時，不能使用Hind Ⅲ和Pst Ⅰ，它們識別的序列位于目的基因的內部會切斷目的基因，只能選擇BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ.由于目的基因兩側沒有合適的酶切序列，所以需要利用PCR技術，在引物設計上注意添加限制酶的識別序列，由于子鏈的延伸是由5′→3′的方向，所以3′端是用來連接新的游離的脫氧核糖核苷酸不能添加與目的基因本身不堿基互補配對的限制酶序列，而要在5′端加入.并且由于目的基因的插入是有方向的，反向接入沒有意義，所以按照題目，Bgl Ⅱ限制酶的識別序列應該接在引物1上，而BamH Ⅰ的酶切序列則加在引物2的5′端.

由于BamH Ⅰ和Bcl Ⅱ屬于同尾酶，所以盡管用了2種酶但是切出了相同的黏性末端.質粒完全酶切后會產生2個片段，且產生的4個黏性末端與DNA酶切后的兩個黏性末端都能夠堿基互補配對，所以在混入了DNA連接酶后，僅考慮片段的相連的話會有6種.

總結：①限制酶的選擇要注意以下幾點：

針對目的基因：不能夠破環目的基因本身，否則連接毫無意義，因此往往要選取目的基因兩側的限制酶切割位點.

針對質粒：因為要與目的基因相連所以要確保產生同種黏性末端即切割質粒和目的基因的限制酶一般是同種.若沒有同種酶則考慮同尾酶（識別序列不同但產生相同的黏性末端.其次限制酶的選擇不能破壞質粒中的重要元件，包括復制原點、啟動子、終止子，且選擇啟動子和終止子之間的限制酶；否則就沒辦法復制和正常表達.有時質粒上有多個標記基因，此時標記基因可以破壞，但必須注意保留一個以便后續目的基因的篩選和鑒定.

②單酶切與雙酶切的選擇：

單酶切有可能使目的基因和質粒的自身環化，也可能導致目的基因反向插入質粒，因此可以使用雙酶切，讓目的基因兩端帶有不同的黏性末端，避免自身環化，使目的基因定向插入質粒.

③目的基因兩側添加合適的酶切序列：

有的時候目的基因兩側并沒有較好的限制酶的酶切位點，所以需要在利用PCR技術擴增目的基因時在引物設計上注意，適當地在引物的5′端帶有限制酶酶切序列.

1.2 EASY法構建表達載體

除了利用限制酶和DNA連接酶來連接2個DNA片段，隨著研究的發展，1990年，科學家舒曼在牛痘病毒中發現了1種拓撲異構酶，它的生理作用主要體現在DNA復制的過程中，同時具有內切酶和連接酶的功能：酶切釋放DNA復制過程中因為解旋而帶來的產生的螺旋力；在復制完成后，將缺口補上，完成DNA的復制，是DNA正常復制的重要保障.因此基于這一原理，科學家嘗試將拓撲異構酶應用于基因表達載體的構建.在2019年江蘇高考就應用了這個科研結果作為背景.

例題2 （2019·江蘇高考）圖3中是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒P0具有四環素抗性基因（tet^r）和氨芐青霉素抗性基因（amp^r）.請回答下面問題：

用TaqDNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有1個腺嘌呤脫氧核苷酸.載體P1用酶處理，在兩端各添加了1個堿基為的脫氧核苷酸.

答案：胸腺嘧啶（T）

分析 根據堿基互補配對原則，由于題干介紹目的基因兩側突出的末端都是以腺嘌呤為堿基的脫氧核糖核苷酸，所以在處理質粒時也需要讓它的兩端各添加1個堿基為胸腺嘧啶的脫氧核苷酸，方便目的基因與載體的連接.

EASY克隆主要原理是將胸腺嘧啶通過磷酸鍵與拓撲異構酶第274位酪氨酸結合，使拓撲異構酶和載體偶聯在一起.當偶聯載體與PCR產物進行連接時，PCR產物3′端羥基撞擊載體與酶之間的磷酸鍵，使其斷裂，拓撲異構酶利用斷鍵釋放的能量發揮連接功能，將片段連接到載體上，同時酶從載體上脫落.這項技術的廣泛應用主要得益于拓撲異構酶本身的特性，它連接速度非常快，所以EASY法構建表達載體會更簡便，反應更快速，連接更高效.不過由于它的原理并不在生物高中課程標準中要求學生理解的概念中，所以圍繞這項技術考查的題目較少，多作為情境出現，并且出題角度依舊從學生已知角度出發，解決常見問題.

1.3 同源重組構建基因表達載體

傳統基因表達載體的構建中應用雙酶切法的很多，但是在實際操作中會遇到很多問題，比如效率問題.不同的限制酶它的最適溫度可能不一樣，它們所需要的緩沖液的成分也不一定相同，因此很有可能會導致最后酶切效率低下或者及連接效率不高，使得篩選重組目的基因非常困難，導致基因工程的失敗.當然為了解決這個問題，越來越多的基因公司改造天然質粒，開發出了帶有合適限制酶的質粒，但是如果基因工程需要用到特殊載體，這些問題又重新出現，因此人們通過研究傳統的基因敲除的方法，將同源重組法應用在了基因表達載體的構建.它逐漸成為了近幾年基因工程考題的情境.

例題3 （2021·江蘇高考）如圖4所示，某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合表達蛋白M和tag標簽的質粒，請結合實驗流程回答下面問題：

重組質粒的構建

①將Sma I切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進，形成A-m結合體.將A-m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及酶等，完成質粒的環化.

②若正確構建的重組質粒A—m仍能被Sma I切開，則Sma I的酶切位點可能在______.

答案：黏性末端堿基配對 DNA連接 基因m的連接處、基因m的內部

解析 這道題目是經典的同源重組構建基因表達載體中的無縫克隆.

第一步，將質粒線性化.在本道題里質粒上存在Sma I的酶切位點，直接利用Sma I切出平末端使得環狀質粒線性化.當讓如果質粒上沒有合適的位點，也可以利用PCR方法實現載體的線性化.

第二步，獲取目的基因.利用PCR擴增目的基因，并在兩個引物的5′端添加與線性化質粒末端相同的同源序列.

第三步，將質粒與目的基因混合并添加雙鏈的核酸外切酶.該酶具有從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸的作用，主要的催化活性是催化雙鏈DNA按3′→5′的方向.

這樣形成黏性末端，然后降溫以促進黏性末端堿基配對.這一過程要控制酶解時間，時間過短，沒有將同源序列的一條鏈全部水解，那目的基因和質粒產生的黏性末端是無法堿基互補配對的，時間可以過長，雖然可能會水解超過同源序列的部分，但不妨礙目的基因與質粒同源序列間的堿基互補序列.

第四步，導入大腸桿菌.剛剛提到在第三步中構建的載體并不完整，還可能存在部分脫氧核苷酸的缺失，但是導入了大腸桿菌后，細胞中本來就存在的DNA聚合酶和DNA連接酶能夠將基因表達載體補全并連接完整.

總結：同源重組法構建基因表達載體對于學生來說是一個非常嶄新的領域，并不是需要學生在平時學習就掌握的內容，更多的是試題提供背景信息，學生在有限的時間里，閱讀題干，迅速了解同源重組的流程和結果，并利用已知來解決問題，考查的是學生的科學思維.學生應該掌握生物新課程標準中要求的基本概念，并能夠靈活運用于新的情境，學會遷移而不是機械地死記硬背.2 思考與總結

基因工程應用廣泛，它的誕生實現了在微生物、植物、動物之間的基因交流，讓人類以前不能實現的種種奇思妙想變為了現實可能.它的原理看似簡單，就是將外源基因成功導入到受體細胞，并且這個外源基因能夠成功在受體細胞中穩定存在、表達并發揮作用，進而賦予生物新的遺傳特性，但其實從理論研究到工程實踐卻并不簡單.通過對表達載體構建技術的發展結合相關試題的研究，發現面對真實科研情境，書本上的傳統操作過程會出現很多問題，學生要學會的是在掌握基礎知識的前提下，開拓思維，利用已有知識嘗試解決問題從而優化相關技術.

當然基因工程技術的革新不僅僅局限于基因表達載體的構建上，比如在目的基因獲取中，以前書本主要是從基因文庫中獲取，但是在新教材中PCR法擴增成為主流.試題也更多地開始考查不同的PCR技術，比如RT—PCR、巢式PCR、重疊延伸PCR、熱啟動PCR等等.在目的基因導入受體細胞中，花粉管通道法和農桿菌轉化法的共同使用；在目的基因的鑒定中，融合基因的應用都出現在了多個考題的情境中，總的來說生物學與生活實際是息息相關的，如果生物的學習僅僅停留在背書來答題，教師的教法僅僅是題海戰術，那就完全違背了高考立德樹人的目的.所以在教學時教學時，教師要以“理解為先”為目標，多關注科學前沿，適當給學生拓展，并在平時課堂上自己通過大量文獻閱讀設計情境引導學生培養批判性思維、創新性思維，提高學生生物核心素養.

參考文獻：

[1] 歐陽一鳴.從高考題看生物論文信息題的命制方式：以2021天津卷13題為例[J].理科考試研究，2022，29（07）：63-65.

[責任編輯：季春陽]