持續壓力對離體培養兔椎體終板內Wnt/β—catenin信號通路及VEGF的影響

展嘉文 馮敏山 王尚全 朱立國 韓濤 尹遜路 魏戌

[摘要] 目的 研究持續壓力對椎體終板內血管內皮生長因子（VEGF）及β-catenin表達的影響，進一步探討VEGF與椎間盤退變之間的分子作用機制。 方法 將16只新西蘭白兔處死后在無菌條件下取出脊柱運動節段，隨機分為對照組與壓力組，每組各8只，均放入離體加載和培養裝置中進行培養，其中壓力組予持續3 kg壓力，對照組不予壓力，于培養前及培養3、7及14 d時，兩組各取10個樣本，應用免疫組化、Western blot、Real-time PCR檢測VEGF及β-catenin的表達情況。 結果 免疫組化檢測結果顯示，持續壓力下培養7 d時，終板內VEGF強度顯著下降（0.182±0.063），與對照組（0.237±0.051）比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；培養14 d時染色強度進一步降低，壓力組（0.156±0.035）與對照組（0.211±0.038）比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；相反，持續壓力上調了終板內β-catenin的表達，培養期間與對照組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。Western blot結果顯示，壓力組與培養前及對照組比較，上調了β-catenin的表達，差異均有統計學意義（P < 0.05）。Real-time PCR結果顯示，持續壓力導致VEGF基因相對表達量減少（0.842±0.002），與對照組（0.965±0.005）比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 持續壓力導致離體培養兔脊柱運動節段內椎體終板VEGF表達下降、β-catenin表達上調，提示持續壓力可能通過Wnt/β-catenin信號通路調節椎體終板內VEGF表達。

[關鍵詞] 椎體終板；血管內皮生長因子；Wnt/β-catenin；持續壓力；椎間盤退變

[中圖分類號] R681.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（c）-0004-05

[Abstract] Objective To study the effect of consistence pressure on the expression of VEGF and beta -catenin in vertebral endplate， and further explore the molecular mechanism between VEGF and intervertebral disc degeneration. Methods A total of 16 New Zealand rabbits were sacrificed after removed under sterile conditions in the spinal motion segment， were randomly divided into control group and pressure group（8 rabbits in each group）. Rabbits were placed in vitro loading and culture device for culture， in which the pressure group were treated with consistence pressure 3 kg， the control group did not under pressure， pro-culture and 3， 7， 14 d after culture， 10 samples were collected from each group， the expression of VEGF and beta-catenin were detected by immunohistochemistry （IHC）， Western blot and Real time-PCR. Results IHC staining showed that the VEGF staining intensity in the endplate under pressure 7 d after cultured decreased significantly（0.182±0.063）， compared with the control group（0.237±0.051）， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the staining intensity was further decreased at 14 d after culture （0.156±0.035）， compared with the control group （0.211±0.038）， the difference was statistically significant（P < 0.05）. On the contrary， the consistence pressure increased the expression of beta-catenin in the endplate， and compared with that of the control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Western blot results showed that compared with fresh specimen and control group， consistence pressure significantly increased the expression of beta-catenin， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Real-time PCR results showed the relative expression of VEGF gene was reduced by consistence pressure（0.842±0.002）， and the difference was significant compared with the control group （0.965±0.005， P < 0.05）. Conclusion Consistence pressure leads to a decrease of VEGF expression and an increase of the expression of beta-catenin in the vertebral endplate of spinal motion segment， which suggests that continuous pressure may regulate the expression of VEGF in the vertebral endplate through the Wnt/beta-catenin signaling pathway.

[Key words] Vertebral endplate； VEGF； Wnt/ beta-catenin； Consistence pressure； Intervertebral disc degeneration

椎體終板是椎間盤營養供應的重要途徑[1]，軟骨細胞是軟骨終板內的唯一細胞類型，其功能受到多種細胞因子的調節，其中血管內皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）與終板內血管新生及椎間盤退變關系密切[2-3]。但VEGF在退變中的作用仍存在爭議[4]，探明VEGF與椎間盤退變之間的分子作用機制，將對相關疾病的治療產生重要意義。本實驗前期研究證實持續壓力誘導椎間盤退變的機制與Wnt/β-catenin信號通路有關[5]，而相關文獻報道該通路對VEGFs也具有調控作用[6-7]。據此，本研究應用離體培養兔脊柱運動節段壓力退變模型，觀察持續壓力對椎體終板內血管及相關細胞因子的影響，以進一步闡述VEGF與椎間盤退變之間的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

ABI7900HT實時定量PCR儀（美國ABI公司）、BioSens SC 810B凝膠成像儀（上海山富科學儀器有限公司）、BC-subMIDI電泳儀（北京六一儀器廠）、Beckman Allgre 21R高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；qPCR試劑盒（美國KAPA Biosystems公司）、Trizol（美國invitroge公司）、引物（上海生工生物工程公司）、胎牛血清（美國Gibco公司）、DMEM/F12培養基（美國Gibco公司）。

1.2 實驗動物

健康新西蘭兔16只，4～6月齡，雌雄不限，2.5～3 kg（中國中醫科學院實驗動物中心提供，合格證號：2014 1002）。

1.3 實驗方法及步驟

1.3.1 取材及培養 根據隨機數字表法將16只實驗新西蘭兔分為壓力組與空白對照組，每組各8只。新西蘭兔麻醉后，耳緣靜脈給予肝素鈉，5 min后空氣栓塞處死，帶入超凈工作臺；立即在無菌條件下自背部縱切口，自尾部完整取出腰段及下位胸段脊柱，入高滲肝素磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗；在2.5倍放大鏡下應用咬骨鉗、手術刀片切取T12/L1、L2/L3、L4/L5、L6/S1脊柱運動節段，共4節段。自相鄰椎間盤的椎體與骨性終板結合處銳性分離，得到完整脊柱運動節段，包括髓核（NP）、纖維環（AF）及上下軟骨終板（EP）及相鄰椎體（VB）；用帶有18號針頭的無菌注射器吸取含肝素的高滲PBS液沖洗標本表面的碎屑及終板上的血凝塊，于含肝素的平衡鹽溶液（HBSS）液（含1000 U/mL青霉素，1 mg/mL鏈霉素）中漂洗2 min。

兩組樣本放入研制的脊柱運動節段離體加載和培養裝置中，壓力組予3 kg壓力，對照組不予負荷。兩組均予細胞培養液DMEM，含有10%胎牛血清、25 μg/mL抗壞血酸、50 mg/mL慶大霉素，并用NaCl將細胞培養液的滲透壓調整到410 mOsm/kg[8]。

兩組均置于5% CO2、37℃恒溫培養箱進行整體培養，每2天更換培養液。分別在培養前（0 d）和培養后第3、7、14天時，取出標本并沿軟骨終板表面下2 mm處分離出椎體終板。

1.3.2 免疫組織化學檢測 椎間盤組織常規石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，PBS沖洗5 min×3次；熱修復法進行抗原修復；山羊血清封閉5 min，加入一抗（Sigma-Aldrich，瑞士），4℃過夜；PBS清洗5 min×3次；加入二抗（Sigma-Aldrich，瑞士），室溫孵育20 min，PBS清洗5 min×3次；滴加DAB（Sigma-Aldrich，瑞士）顯色，約3 min，PBS清洗；蘇木精復染30 s；梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封片后置于顯微鏡（Nikon，TS100，日本，×100）下觀察VEGF及β-catenin的表達情況。

1.3.3 Western blot法檢測VEGF及β-catenin的表達 收集各時間點椎體終板，加入適量裂解液，樣品置于冰上以30%振幅超聲，工作3 s后間歇暫停2 s，每個樣品累積超聲約30 s，12000 r/min離心15 min后吸取上層總蛋白溶液。BCA法測定蛋白濃度，等量分裝后以上樣緩沖液煮沸變性。SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜，5% BSA封閉1 h，相應一抗孵育過夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h，TBST洗膜，ECL試劑檢測蛋白表達，計算機圖像分析儀測定灰度值。

1.3.4 Real-time PCR檢測VEGF及β-catenin的表達情況 收集各時間點椎體終板，加入適量Trizol裂解液，將樣品置于冰上以30%振幅超聲，工作3 s后間歇暫停2 s，每個樣品累積超聲約30 s。隨后陸續以氯仿、異丙醇、酒精等試劑對總RNA進行提取，并測定RNA的濃度；用反轉錄試劑盒（KAPA Biosystem，美國）將RNA反轉錄為cDNA，然后以cDNA第1鏈作為模板行PCR擴增，PCR反應體系：Nuclease-Free Water 1.6 μL，GoScriptTM5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2 2 μL，PCR Nucleotide Mix 1 μL，Recombinant RNasin Ribonulease Inhibitor 0.4 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，32個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統軟件測定灰度值并計算相對強度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，組內比較采用單因素方差分析，時間因素單獨效應分析采用重復測量方差分析；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測椎體終板中VEGF與β-catenin表達

免疫組化法檢測椎體終板中VEGF顯示：壓力組培養3 d時與培養前標本相比明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05），但與對照組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）；培養7 d時與對照組相比明顯下降，培養14 d時強度進一步降低，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表1。而β-catenin免疫組化法檢測卻顯示：壓力組培養14 d時強度明顯加深。與培養前標本比較，持續壓力上調了終板內β-catenin的表達（P < 0.05），培養期間與對照組同時間點比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 Western blot檢測椎體終板中β-catenin表達

與培養前標本比較，持續壓力上調了終板中β-catenin的表達，且隨著培養時間延長，表達逐漸增強，培養期間與對照組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.3 RT-PCR檢測椎體終板中VEGF的表達

RT-PCR檢測VEGF基因表達，與培養前比較，對照組3 d時VEGF表達水平無明顯下降，差異無統計學意義（P > 0.05）；培養至14 d時VEGF表達水平較培養前明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05），但培養期間差異無統計學意義（P > 0.05）；壓力組培養期間VEGF表達明顯下降，差異均有統計學意義（P < 0.05）；各時間點兩組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

3 討論

椎體終板是椎間盤營養供應的重要途徑，終板內的血管芽是椎間盤營養物質交換的結構基礎[9-10]，其破壞將造成椎間盤營養障礙，導致椎間盤退變。相關文獻報道持續壓力可使終板下血管分布減少造成營養障礙[11-12]，但異常應力導致終板內血管損傷的機制仍缺乏深入研究。

3.1 持續壓力負荷對椎體終板內VEGF的影響

終板內的軟骨細胞受到多種細胞因子的調節，其中VEGF與終板內血管新生及椎間盤退變關系密切[13-14]。VEGF可由許多正常細胞產生和分泌，主要通過旁分泌途徑作用于內皮細胞[15]。通過一系列信號傳導使內皮細胞分裂、增殖、遷移，形成新生血管，建立側支循環，增加缺氧、缺血組織的氧供、血供，從而減輕或逆轉細胞的受損，改善器官功能等多種功能[15]。軟骨細胞是終板中VEGF的重要來源細胞，VEGF的表達上調可促進終板下毛細血管生成，維持終板下血管袢的數量，延緩椎體終板退變，從而保證椎間盤的營養供應[16]。

相關前期研究發現[17-18]，持續的靜態加載會逐漸抑制椎間盤的細胞合成代謝活力，破壞椎體終板內營養通道、造成椎間盤營養供應障礙，進而引發椎間盤退變。在此基礎上，本研究從分子作用水平進一步闡述異常應力導致椎間盤營養障礙誘發其退變的發生機制。實驗結果提示，持續壓力導致離體培養兔脊柱運動節段椎體終板內VEGF表達減少，提示VEGF參與了椎間盤壓力退變過程，其在退變的發病過程中可能起著重要作用。

3.2持續壓力負荷對椎體終板內Wnt/β-catenin信號通路的影響

Wnt信號通路調控網絡在椎間盤的形成、生長、退變和修復的過程中起著十分重要的作用[19]。Wnt/β-catenin信號過度激活，將引起嚴重的椎體軟骨終板細胞破壞、纖維環細胞層狀結構的紊亂和髓核細胞蛋白多糖的減少，引起椎間盤結構的變形[20]。終板軟骨細胞對Wnt信號通路非常敏感[20]，并可引起不可逆的退變。但同時也有研究發現抑制Wnt信號通路會導致軟骨終板和類軟骨細胞發生不同程度的生長性損傷，Wnt/β-catenin信號通路的適度活化對上述椎間盤組織的生長發育以及功能起著不可或缺的作用。正確地控制Wnt通路對于建立椎間盤組織和促進椎間盤組織的生長有重要的意義[21-22]。

實驗前期研究發現適量的壓力負荷短期內刺激了椎間盤表達分泌Ⅱ型膠原，且有利于防止組織膨脹和保持細胞活性，但持續的靜態加載會逐漸抑制細胞的合成代謝活力，尤其對蛋白多糖的影響較為明顯，從而造成了椎間盤退變[23-24]，而初步試驗結果顯示持續壓力誘導退變的機制與Wnt/β-catenin信號通路密切相關。

3.3 Wnt/β-Catenin信號通路與VEGF

通過Wnt/β-catenin經典途徑，能夠促進血管內皮細胞的增殖、血管芽生與血管叢重塑，以促進組織的修復與愈合[25-26]。當Wnt信號通路被激活后，糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）蛋白的活性受到抑制，從而抑制了β-catenin的降解，使其在細胞質中大量聚集，并與轉錄因子T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）家族結合，轉移至細胞核內，激活下游靶基因VEGF轉錄。大量研究證實β-catenin和VEGF具有明顯的相關性[26-28]，但在終板軟骨組織中Wnt/β-catenin通路是否對VEGF具有調控作用鮮見報道。

本研究結果顯示在持續壓力狀態下，隨著離體培養時間延長，模型椎體終板內VEGF表達逐漸下降，而β-catenin持續上調，提示β-catenin表達與VEGF表達存在相關性。基于此研究結果及文獻報道，研究者推測在椎體終板組織中Wnt/β-catenin通路對VEGF具有調控作用，還將深入研究椎體終板組織中Wnt/β-catenin信號通路對VEGF的具體調控機制。

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