褪黑素通過HIF—1α/VEGF信號通路減輕急性腎損傷的研究

馮杰+++++佟小雅++++++俞佳麗++++++潘祉諭+++++查艷

[摘要]目的 探討脂多糖（LPS）誘導的急性腎損傷中低氧誘導因子1α（HIF-1α）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達及褪黑素（Mel）對其表達的影響。方法 選取3～5周齡的30只Sprague-Dawley（SD）大鼠作為研究對象，隨機分為對照組（n=10）、LPS組（n=10，靜脈注射500 μg/kg LPS）、Mel+LPS組（n=10，注射LPS之前15 min給予Mel）。48 h后采用TBA法檢測腎組織的丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，分別用RT-qPCR和免疫組化檢測HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達水平。結果 LPS組腎小管上皮細胞腫脹、腎間質水腫，有炎細胞浸潤；Mel+LPS組的上述表現明顯減輕。LPS組血清BUN和Scr含量[（35.56±1.83）mmol/L和（46.23±2.87）μmol/L]顯著高于對照組[（12.69±0.97）mmol/L和（16.73±1.26）μmol/L]以及Mel+LPS組[（23.17±1.33）mmol/L和（35.67±2.25）μmol/L]（P<0.05）。LPS組小鼠腎組織的MDA水平[（697.45±43.13）nmol/（mg·prot）]與對照組[（354.35±28.12）nmol/（mg·prot）]比較急劇增高（P<0.05），Mel+LPS組的MDA[（455.37±30.79）nmol/（mg·prot）]與LPS組比較則明顯降低（P<0.05）。LPS組小鼠腎組織的SOD水平[（3.75±0.23）U/（mg·prot）]與對照組[（2.93±0.29）U/（mg·prot）]比較急劇降低（P<0.05），Mel+LPS組的SOD水平[（3.20±0.27）U/（mg·prot）]與LPS組比較明顯增高（P<0.05）。LPS組小鼠腎組織的HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白水平與對照組相比急劇增高（P<0.05），Mel+LPS組與LPS組比較明顯降低（P<0.05）。結論 Mel通過抑制MDA的產生和上調SOD的活性，調控HIF-1α和VEGF的表達，起到了保護LPS誘導的急性腎損傷（AKI）腎臟功能的作用。

[關鍵詞]褪黑素；腎損傷低氧誘導因子1α；血管內皮生長因子

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（b）-0012-04

[Abstract]Objective To investigate the expression and influence of melatonin on hypoxia-inducible factor （HIF-1α） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in acute kidney injury induced by lipopolysaccharide （LPS）.Methods 30 Sprague-Dawly（3-5 weeks） rats were selected and randomly divided into the control group （n=10），the LPS group （n=10，500 μg/kg LPS was injected intravenously） and the Mel+LPS group （n=10，melatonin was administrated orally，15 min later，LPS was given），followed by 48 hours，the rats were killed.The thiobarbituric acid （TBA） test was given to detect the level of MDA and the activity of superoxide dismutase （SOD）.The mRNAs and proteins of HIF-1α and VEGF were determined by RT-qPCR and immunohistochemistry.Results There was renal tubular epithelial cells swelling，renal interstitial edema and inflammation in the LPS group，those symptoms was attenuant in Mel+LSP group.The level of Scr and BUN in the LPS group [（35.56±1.83）mmol/L and （46.23±2.87）μmol/L] was higher than that in the control group [（12.69±0.97）mmol/L and （16.73±1.26）μmol/L] and the Mel+LPS group [（23.17±1.33）mmol/L and （35.67±2.25）μmol/L] （P<0.05）.The level of MDA in the LPS group [（697.45±43.13）nmol/（mg·prot）] was higher than that in the control group [（354.35±28.12）nmol/（mg·prot）] and the level of MDA in the Mel+LPS group [（455.37±30.79）nmol/（mg·prot）] was lower than that in the LPS group （P<0.05）.The level of SOD in the LPS group [（3.75±0.23）U/（mg·prot）] was lower than that in the control group [（2.93±0.29）U/（mg·prot）] and Mel+LPS group[（3.20±0.27）U/（mg·prot）] （P<0.05）.The level of HIF-1α and VEGF mRNA and protein in the LPS group was higher than that in the control group，and less than that in the Mel+LPS group.Conclusion By inhibiting the production of MDA and up regulating the activity of SOD，Mel can regulate the expression of VEGF and HIF-1α，and plays a role in protecting LPS induced AKI renal function.

[Key words]Melatonin；Renal injury hypoxia inducible factor-1α；Vascular endothelial growth factor

內毒素血癥（endotoxemia，ETM）可出現在兒科多系統的多種疾病中，一旦并發腎損傷常難以救治。缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在多種腎損傷的動物模型中具有腎臟保護作用，其在腎損傷發病過程中的作用在臨床研究中也備受關注。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是HIF-1α最重要的靶基因之一，在缺氧情況下可被HIF-1α迅速誘導活化。褪黑素（melatonin，Mel）是松果體分泌的吲哚類神經內分泌激素，目前臨床上主要用于內分泌和腫瘤等其他疾病的治療。近年來的研究表明，Mel對ETM腎損傷具有保護作用。本實驗通過觀察ETM幼年大鼠腎組織中HIF-1α、VEGF的表達，探討Mel干預對ETM腎損傷的作用及其對HIF-1α介導的VEGF表達的影響。

1材料與方法

1.1材料

血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑購自Cell Signaling Technology，脂多糖（lipopo-lysaccharide，LPS）購至Sigma， Mel購自Sigma-Aldrich，兔抗HIF-1α抗體、兔抗VEGF抗體和兔抗β-actin抗體購自Abcam，HRP標記的山羊抗兔IgG購自博興生物，DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天，RT-qPCR試劑盒購自Thermo Fisher Scientific。清潔級3～5周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，購自貴州醫科大學動物實驗中心。

1.2動物模型建立

將3～5周齡清潔級SD大鼠隨機分為對照組、LPS組、Mel+LPS組，每組10只。LPS組靜脈注射500 μg/kg LPS，Mel+LPS組注射LPS之前15 min給予Mel，然后500 μg/kg LPS靜脈注射，48 h后，麻醉下處死幼年大鼠，采血1 ml，取雙側腎臟。

1.3大鼠腎功能相關指標檢測及病理學檢測

全自動生化儀測Scr、BUN。處死大鼠，取腎組織用于病理檢測。石蠟切片常規過碘酸希夫反應（periodic acid-Schiff reaction，PAS）染色，光鏡下雙盲法觀察腎小管間質的變化情況。

1.4大鼠腎臟氧化應激相關指標檢測

腎組織勻漿（0.01 mol/L PBS緩沖液以產生10%組織裂解液），按照試劑盒說明書操作，用硫代巴比妥酸（TBA）法測定腎臟的MDA水平，檢測535 nm處吸光度，結果用nmol/（mg·prot）表示。用超氧化物歧化酶SOD測定試劑盒檢測腎臟SOD活性，按照試劑盒說明書操作，檢測550 nm處吸光度，結果用U/（mg·prot）表示。

1.5免疫組織化學法檢測腎組織HIF-1α和VEGF的蛋白表達

石蠟切片2 μm，常規脫蠟至水，滅活內源性酶，熱修復抗原。加1∶150稀釋的兔抗HIF-1α抗體、兔抗VEGF抗體，4℃過夜；生物素標記抗兔IgG（1∶1000），室溫孵育2 h；洗滌后，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素工作液孵育，37℃，30 min，DAB顯色，封片、顯微鏡觀察。

1.6 RT-qPCR檢測腎組織HIF-1α和VEGF mRNA的表達

Trizol裂解細胞提取總RNA，用紫外可見分光光度儀測定其純度和含量。反轉錄得到cDNA。熱循環的條件：94℃變性30 s，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環30次。mRNA的表達變化用2ΔΔCt表示。

1.7統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組腎組織HE染色的病理學變化

LPS組的腎小管上皮細胞腫脹、腎間質水腫，有炎細胞浸潤。Mel+LPS組與LPS組比較，上述表現明顯減輕（圖1）。

2.2各組腎功能變化和氧化應激相關指標的比較

LPS組的血清BUN、Scr含量顯著高于對照組，Mel+LPS組的BUN、Scr含量顯著低于LPS組，差異有統計學意義（P<0.05）。LPS組小鼠腎組織的MDA水平顯著高于對照組，Mel+LPS組小鼠腎組織的MDA水平顯著低于LPS組，差異有統計學意義（P<0.05）。LPS組小鼠腎組織的SOD水平顯著低于對照組，Mel+LPS組小鼠腎組織的SOD水平顯著高于LPS組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3 Mel對HIF-1α mRNA和蛋白表達的影響

LPS組小鼠腎組織的HIF-1α mRNA（4.35±1.87）和蛋白水平（6.82±1.97）與對照組（1.00±0.00）和（3.29±0.57）相比急劇增高，差異有統計學意義（P<0.05）。Mel+LPS組的HIF-1α mRNA（2.35±0.76）和蛋白水平（3.95±1.02）與LPS組比較明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2、圖3）。

2.4 Mel對VEGF mRNA和蛋白表達的影響

LPS組小鼠腎組織的VEGF mRNA（2.01±1.32）和蛋白水平（4.34±1.26）與對照組（1.00±0.00）和（2.53±0.74）相比明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。Mel+LPS組的VEGF mRNA（1.35±0.18）和蛋白水平（2.55±0.75）與LPS組比較明顯下調，差異有統計學意義（P<0.05）（圖4、圖5）。

3討論

ETM可出現在兒科多系統的多種疾病中，是兒科ICU中重癥感染患兒最常見的死亡原因之一。腎臟是其重要靶器官，一旦并發急性腎損傷（AKI）常難以救治[1]。近年來，HIF-1在某些腎臟疾病中的作用逐漸受到關注，然而，HIF-1活性及其對下游基因VEGF的表達調控在ETM幼年大鼠腎損傷過程中扮演的角色尚不清楚[2]。Mel是松果體分泌的吲哚類神經內分泌激素，是目前最為強效的自由基清除劑，在腎臟疾病中發揮著抗氧化、抗凋亡和免疫調節作用[3]。

3.1 Mel對LPS誘導的腎功能的保護作用

Mel主要作為治療失眠的睡眠調節劑。Mehta等[4]證實，血液透析終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）患者體內的Mel水平明顯低于正常人，血液透析患者可以通過攝入Mel改善其睡眠質量。日本學者發現，其可延緩腎臟肥大的發生、發展。本研究結果顯示，LPS誘導的大鼠腎功能受損，Scr和BUN增高，Mel+LPS使大鼠腎功能明顯改善，Scr和BUN明顯降低。這一結果驗證了Mel能夠改善腎功能的結論。

3.2 Mel對氧化應激相關指標的影響

在正常情況下，活性氧被少量釋放且被內生的抗氧化劑所拮抗，如過氧化氫酶[5-7]。高水平和低水平的氧分壓都會增強氧化應激，這使得維持組織的含氧量處在生理水平，能夠避免氧化應激給組織帶來的損傷。組織MDA水平可代表組織的氧化應激水平，而SOD為組織清除氧自由基的主要酶[8-11]。Sasabe等[12]發現Mel能夠調節MDA和SOD的表達，從而防止細胞的DNA損傷。

在乳腺癌組織內，Mel能夠通過SOD抑制HIF-1α，同時抑制HIF-1α誘導的VEGF的表達[13-15]。本研究結果顯示，Mel能夠保護腎功能，且Mel能夠下調HIF-1α和VEGF。

Mel能逆轉LPS誘導的腎組織的MDA增高而使SOD減少。LPS誘導的氧化應激加重了AKI小鼠的腎臟功能障礙。Mel通過抑制MDA的產生、上調SOD的表達、活性調控HIF-1α和VEGF的表達起到了抗氧化應激保護LPS誘導的AKI腎臟功能的作用，這為研究Mel在腎臟中的保護作用提供了一定的實驗依據。

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