牛王刺對CIA大鼠Treg/Th17細胞平衡影響的實驗研究

石江梅 王羿 梁子聰 劉運麟 朱勝章

【摘要】目的：觀察牛王刺（CD）水提液對CIA誘導大鼠Treg/Th17細胞平衡的影響，探討牛王刺抗類風濕性關節炎的作用機制。方法：CIA誘導建立關節炎模型，將50只SD大鼠隨機分為正常組，模型組，陽性組，牛王刺水提液低、高劑量組，采用ELISA法檢測各組血清11-1 β、IL-6及TNF-α含量，Western Bolt法檢測大鼠滑膜11-1 β，IL-6，TNF-α，IL-17，ROR v t，Foxp3的蛋白表達水平。結果：與正常組比較，CIA誘導模型組大鼠血清中11-1 β、IL-6及TNF-α水平顯著增高（P<0.01），滑膜中11-1 β，IL-6，TNF-α，IL-17，ROR V t的蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），而Foxp3的蛋白表達水平顯著下降（P<0.01）;與模型組比較，牛王刺治療組的血清中11-1 β、IL-6及TNF-α水平明顯下降（P<0.05），滑膜中11-1 β，IL-6，TNF-α，IL-17，ROR v t的蛋白表達水平明顯下降（P<0.0 5），Foxp3的蛋白表達水平明顯上升（P<0.0 5），高劑量組尤為明顯。結論：牛王刺可調節CIA誘導關節炎大鼠Treg/Th17細胞平衡，抑制炎性細胞因子生成，這可能是牛王刺抗RA的治療作用機制之一。

【關鍵詞】牛王刺;類風濕性關節炎;Treg細胞：TH17細胞;平衡

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，致殘率高，其病因、發病機制尚不清楚[1]。眾多研究認為RA的發病與體內免疫學紊亂密切相關，其中Treg/Th17細胞平衡是近年研究RA發病的焦點之一。Th17是產生重要的致炎性細胞因子IL-17的關鍵效應細胞，促進RA的發生和發展。而Treg細胞可抑制T細胞抗原呈遞，減少炎性細胞產生，延緩或抑制RA病程進展[2]。

目前，RA在臨床上沒有較好的根治方案，大部分治療藥物效果不理想，副作用較大。研發療效確切，毒副作用小的抗RA藥物仍是今后研究的重要方向。我國民間使用植物藥治療RA具有悠久的歷史，但許多藥物的作用機制尚不明確。牛王刺為豆科植物云實Caesalpinia decapetala（ Roth.）的干燥根，常被土家族民間醫師用于治療RA。前期研究己證實牛王刺（CD）能提高大鼠痛閾，降低毛細血管通透性，抑制炎性腫脹[3]。為更好挖掘、開發民族藥物資源，探討其治療RA的作用機制，本研究通過建立CIA大鼠模型，觀察牛王刺對Treg/Th17細胞平衡的影響，為其治療RA提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠50只，清潔級，雌雄各半，由重慶第三軍醫大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（渝）2012-0003。體重平均為（150±3 0）g，在清潔級實驗室適應性飼養1周。

1.2 試劑及儀器

牛王刺飲片購于黔南州百姓人連鎖大藥房，由黔南州中醫醫院胡建山教授鑒定為云實Caesalpinia decapetala （Roth.）的干燥根。雷公藤多苷片（tripterygiumglycoside，TG）購于貴州漢方制藥有限公司。牛II型膠原蛋白和弗氏完全佐劑（Chondrex公司），IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒（上海江萊生物科技公司）。RORt、Foxp3抗體（Sigma公司），IL-17、β-actin抗體、二抗、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程公司）。Leica全封閉式組織脫水機（型號ASP 300 S）、Leica全自動輪轉式切片機（型號RM 2265）、Thermo公司酶標儀（型號MultiskanGO）、Eppendorf臺式高速冷凍離心機（型號5427 R）、上海安亭科學儀器廠恒溫箱（型號DDIL-5），其他常用生化試劑為國產分析純。

2 方法

2.1 牛王刺水提液的制備

將牛王刺飲片烘干、磨粉，加純凈水煎煮2小時后過濾，再加純凈水煎煮l小時后過濾，合并煎液，濃縮得到牛王刺水提濃縮液（約每克相當于l克原藥）。冷藏備用。

2.2 CIA的制備、模型建立與評價

CIA配制[4]：牛Ⅱ型膠原溶解在0.05mol·L^-1的醋酸中，配制成2g·L^-1的膠原溶液，4℃過夜。次日冰浴條件下，滴加等體積CFA，混合、震蕩充分乳化成CIA（終濃度為lg.L^-1）。大鼠建模：常規消毒后，予O.lmL的CIA在大鼠尾根部周圍作皮內注射，l周后按同法再次加強注射。模型判斷標準[5]：用關節炎指數（AD作為判斷標準。按大鼠關節腫脹程度分0～Ⅳ級。0級：足趾無紅腫，0分;I級：足趾關節稍腫，1分;Ⅱ級：小趾關節及足趾關節腫脹，2分;III級：踝關節以下足趾腫脹，3分;Ⅳ級：包括踝關節在內的全部足趾腫脹，4分。AI值一四肢關節腫脹等級評分之和（單肢最高4分，總分為16分）。AI值≥4分的可認定造模成功，<4分的大鼠將從實驗中剔除。本實驗所有造模大鼠均造模成功。

2.3 動物分組及處理

50只Wistar大鼠被隨機分成5組，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組、牛王刺低劑量組、牛王刺高劑量組，每組均為10只。正常對照組不作任何處理，余組均作CIA注射造模。造模后第10天開始藥物治療，陽性對照組給予雷公藤多苷（25mg.kg^-1），牛王刺用量參考前期動物實驗劑量吲，分別以50mg.kg^-1和lOOmg·kg-1作為低劑量組和高劑量組，正常對照組和模型組分別給予等體積雙蒸水ig，所有大鼠按照l mL·100 g^-1g給藥，1次/日。

2.4 觀察指標

2.4.1 ELISA法測定血清IL-1β，IL-6，TNF-α含量

灌胃治療31d后，斷頭處死大鼠取血，腹腔靜脈穿刺取得血液標本后以4 000 r.mm_1離心，取血清部分，按說明書操作采用ELISA法測定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.4.2 Westem blot法檢測滑膜組織IL - 17，RORγt，Foxp3的蛋白表達水平

處死大鼠后，取下大鼠踝關節滑膜組織，裂解后提取總蛋白，BCA法檢測蛋白含量，上樣量為30μg/孔，PCR儀100℃變性5min，獲得蛋白樣本，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電壓80V電泳30 min，待Marker條帶跑出后，將電壓調成120 V繼續電泳90 min，見溴酚藍到達理想位置時中止電泳，將凝膠電轉至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉溶液37℃封閉2h，加一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌5minx3次，加二抗，37℃孵育1h，再次洗膜，ECL發光顯影，成像，獲取條帶圖像，用QuantityOne軟件進行蛋白條帶灰度分析。以p-actin作為內參對照，求出蛋白相對表達量，每個樣本重復3次。

2.4.3 數據統計

應用SPSS 22.0軟件統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用One-Way ANOVA分析。方差齊時，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;方差不齊時，則采用非參數檢驗。P<0.05時，差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清11-1 β，IL-6，TNF-α含量比較

由圖l可知，與正常對照組比較，CIA造模各組大鼠血清IL-1β，IL-6及TNF-α的含量顯著升高（P<0.01）。TG組、CD-L組及CD-H組大鼠血清IL-1β，IL-6及TNF-α的含量均低于模型組（P<0.05）。CD-H組大鼠血清IL-6、TNF-a的含量低于TG組（P<0.05）。

3.2 滑膜IL - 17，RORγt，Foxp3的蛋白表達水平比較

由圖2可知，與正常對照組比較，CIA造模大鼠關節滑膜中IL - 17，ROR帷的蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），而Foxp3的蛋白表達水平顯著下降（P<0.01）。與模型組相比，TG組、CD-L組及CD-H組大鼠滑膜中IL-17，RORt的蛋白表達水平均明顯降低（P<0.05），Foxp3的蛋白表達水平明顯上升（P<0.05）。CD-H組大鼠滑膜中RORγt的蛋白表達水平低于TG組（P<0.05）。

4 討論

RA的病變是以關節滑膜損傷、軟骨和骨破壞為主，免疫失衡引起損傷性細胞因子大量釋放是其病變的主要環節。11117細胞的促炎作用與Treg細胞的抑炎作用及其調節失衡在RA發病過程中占重要地位。11117細胞（T-helper 17 cells）是CD4+T細胞家族中的一個新的亞群，IL-17是其分泌的主要炎性因子，具有較強的炎性反應介導能力，與多種自身免疫性疾病的發病相關。IL-17是一種重要的炎性因子，在RA患者血清及關節液中含量明顯高于正?；颊撸苷T導IL-1β、IL-6及TNF-α等細胞因子表達，促進關節滑膜增生，抑制軟骨修復，加速骨質破壞。臨床及實驗研究表明，Treg細胞（regulatory T cells）的數量及功能異常與RA發生密切相關。Treg細胞可以釋放白介素-10（IL-IO）、轉化生長因子一β （TGF-β）等細胞因子，抑制T淋巴細胞傳遞抗原，從而發揮免疫調節功能，抗衡Th17細胞及其介導的促炎作用。同時，TGF-β單獨或協同IL-10作用，促進叉頭狀轉錄因子P3 （Foxp3）表達，增強Treg細胞活性，抑制Th17細胞分化。Treg細胞還可以通過SATA5通路降低RORγt的表達，發揮抑制Th17細胞活性的作用。

Treg/Th17細胞平衡成為近年來抗RA藥物的切入點。實驗證明，TNF-α/IL-17雙抗（anti-TNF-α/IL-17 antibodies）可以抑制關節炎大鼠細胞因子、趨化因子和基質酶反應，保護軟組織，恢復骨代謝平衡。GRIM-19基因的生物抑制劑通過抑制CIA大鼠11117細胞分化，增加Treg細胞的表達，從而減少IL-1β、IL-6、TNF-α，IL-17等細胞因子的表達，達到治療RA的目的。在中醫藥研究方面，雷公藤多苷、人參皂苷均可上調膠原誘導關節炎大鼠外周血Treg細胞表達，降低血清IL-17含量，恢復Treg/Th17細胞平衡，發揮抗RA的作用。李凝等認為青藤堿可能通過抑制RA患者外周血Th17細胞生成，增加Treg細胞數量，產生RA的治療作用。朱陽春等報道，補腎通督膠囊可以明顯降低RA患者外周血IL-17含量，上調血清TGF-β、IL-IO含量，使Th17/Treg水平下降，緩解RA患者的臨床癥狀。

牛王刺具有祛風除濕，散瘀止痛，解毒消腫功效，是土家族醫師常用于治療RA的經驗藥物，也被現代藥理實驗證實具有抗炎、鎮痛的作用。進一步的藥理作用研究，有助于揭示牛王刺對RA的治療作用機制，為RA患者提供更多元化的用藥選擇。本研究結果顯示，牛王刺水提物能顯著降低CIA大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-a含量，亦能顯著下調關節滑膜中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17，ROR丫t的蛋白表達水平，以及上調Foxp3的蛋白表達水平。這提示其作用機制可能與提高Treg細胞的數量，上調Foxp3及降低RORγt的表達，從而抑制Th17細胞分化以及其介導的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17等細胞因子釋放有關。結果表明，通過恢復Th17/Treg細胞平衡，抑制CIA大鼠滑膜細胞增生，減輕軟骨和骨破壞，延緩病程進展。

綜上所述，本研究證實牛王刺可能通過調節Th17/Treg細胞平衡，減輕炎癥反應對關節滑膜與軟骨、骨的損害，而產生治療RA的作用。但自身免疫疾病是多種炎性因子共同參與的，并與多條信號通路互聯相關，要清晰揭示牛王刺治療RA的作用機制尚需進一步研究。

參考文獻

[1]Bellucci E，Terenzi R，La PagliaG M， et al. One year in review2016： pathogenesis of theumatoidarthritis[j]. Clinica l&ExperimentalRheumatology，2016，34（05）：793.

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[3]張瑩，周小莉.Th17/Treg平衡在類風濕關節炎發病和治療中的意義[J].中國醫藥導報，2015，12 （24）：48-52.

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[5]梁秀軍，孫同友，董文娟等，穿山龍總皂苷對膠原性關節炎大鼠炎性細胞因子的影響[J].時珍國醫國藥，2013，24 （03）： 522-524.