鈣離子非依賴電壓依賴分泌模型(CiVDS)的分子機(jī)制

經(jīng)典的囊泡分泌模型是由動(dòng)作電位激活細(xì)胞膜上的電壓門控鈣離子通道，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流從而引發(fā)鈣離子依賴的分泌(CDS)。在大鼠初級感覺神經(jīng)元(DRG)，研究者發(fā)現(xiàn)了一種特殊的囊泡分泌模型—鈣離子非依賴電壓依賴分泌模型(CiVDS)，其分子機(jī)制為：電壓門控N型鈣離子通道(Cav2.2)與囊泡分泌所必須的SNARE蛋白偶聯(lián)在一起，當(dāng)發(fā)生動(dòng)作電位時(shí)Cav2.2發(fā)生構(gòu)象變化通過SNARE蛋白介導(dǎo)囊泡與質(zhì)膜融合，從而釋放ATP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）：CiVDS的分子結(jié)構(gòu)單元包含3個(gè)組成部分：電壓感受器(Cav2.2)，囊泡融合必需的SNARE蛋白復(fù)合體，以及前兩者之間的連接器（synprint區(qū)域，位于Cav2.2第二個(gè)domain和第三個(gè)domain之間的胞內(nèi)連接區(qū)域）。證據(jù)如下：（1）使用細(xì)胞膜電容(Cm)記錄等方法，發(fā)現(xiàn)特異性Cav2.2阻斷劑芋螺毒素(ω-conotoxin GVIA)能有效抑制CiVDS；（2）CiVDS在3天培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中會(huì)顯著降低，降低的CiVDS能被Cav2.2過表達(dá)所恢復(fù)；（3）在體水平敲低Cav2.2表達(dá)水平能顯著阻斷CiVDS；（4）Cav2.2電壓感受區(qū)域?qū)τ贑iVDS很關(guān)鍵，而Cav2.2離子通透區(qū)域?qū)τ贑iVDS作用有限；（5）使用電鏡(EM)和TIRF成像方法，我們觀察到在CiVDS的刺激條件下DRG神經(jīng)元中小而清亮的囊泡發(fā)生了量子化釋放；（6）3天培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中CiVDS的顯著降低能被SNAP-25的過表達(dá)恢復(fù)；（7）破傷風(fēng)毒素和肉毒桿菌毒素破壞SNARE蛋白復(fù)合體能顯著阻斷CiVDS；（8）在DRG神經(jīng)元中，Cav2.2的synprint區(qū)域介導(dǎo)Cav2.2和SNAP-25的直接相互作用；（9）全細(xì)胞灌注synprint多肽阻斷Cav2.2與SNARE蛋白的相互作用，并能有效抑制CiVDS ；（10）synprint截?cái)嗟腃av2.2失去了恢復(fù)CiVDS的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（二）：ATP是CiVDS的囊泡分泌物，證據(jù)如下：（1）在CiVDS刺激條件下，通過熒光素酶法能檢測到大量ATP的釋放；（2）EM成像顯示在CiVDS刺激條件下質(zhì)膜上停靠的囊泡數(shù)量減少；……