蛹蟲草菌種退化的檢測方法和影響因素

孟小麗 李翠新

摘要 從蛹蟲草菌種的退化表現、早期的檢測方法、菌種退化的影響因素和退化菌種的復壯等方面對蛹蟲草菌種退化進行總結，以期為蛹蟲草菌種退化的研究提供新思路。

關鍵詞 蛹蟲草；菌種退化；檢測方法；影響因素；復壯

中圖分類號 S567.3+5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0133-02

Detection Method and Influencing Factors of Strain Degradation of Cordyceps militaris

MENG Xiao-li，LI Cui-xin*

（College of Life Sciences， Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650051）

Abstract The strain degradation of Cordyceps militaris was summarized from the aspects of the degradation performance of strain， the early detection method， the influencing factors of the strain degradation and the strain rejuvenation of Cordyceps militaris，which provides a new idea for the study of the strain degradation of Cordyceps militaris.

Key words Cordyceps militaris；Strain degradation；Detection method；Influencing factors；Rejuvenation

蛹蟲草（Cordyceps militaris），即北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式菌，分類學上屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）肉座菌目（Hypocreales）蟲草菌科（Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）[1]。蛹蟲草是一種新資源食品，它富含許多種營養與活性成分，其中有蟲草素、蟲草酸、多種人體必需氨基酸、微量元素、維生素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等[2-3]，這些活性成分使得蛹蟲草具有抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤以及提高人體免疫力的功效[4-5]。蛹蟲草和冬蟲夏草是同屬異種的食藥用真菌，有研究表明，蛹蟲草的蟲草素、K、Ca、Se、維生素等對人體有益的活性成分含量高于野生冬蟲夏草[6-7]。

蛹蟲草是一種極好地研究真菌退化機理的材料。如今，人工培育蛹蟲草的技術相對成熟并且已經走入工廠進行產業化的生產，具有非常廣闊的市場前景，但在生產實踐中，蛹蟲草的菌種極易發生退化，一般只能使用半年不到，有的只是傳種幾代就會產生嚴重的退化現象，表現出來的特征大多為不長或是只能長出非常少量的子實體，而且子實體的質量極差，給實現大規模的生產栽培帶來了極大的風險[8]。因此，如何解決蛹蟲草菌種容易退化的問題，是國內外學者研究的熱點，而關于其退化的遺傳機理方面的研究很少[9]。筆者從蛹蟲草菌種的退化表現、早期的檢測方法、菌種退化的影響因素和退化菌種的復壯等方面對蛹蟲草菌種退化進行總結。

1 蛹蟲草退化的表現

在人工栽培中，退化的表現有白臉現象、產生絨狀菌絲、氣生菌絲旺盛、吐黃水現象、子實體分叉或畸形（圖1）。用顯微鏡對蛹蟲草的菌絲進行觀察，蛹蟲草正常的菌絲較為粗壯挺立、分生孢子為念珠狀，而退化的菌絲比較纖細彎曲，分生孢子為頭狀或山丘狀[10]。退化菌種的子實體頂端及上部子囊殼有很多，正常菌種的子實體頂端及上部只有少量或沒有子囊殼[11]。

2 早期檢測方法

2.1 脫色能力測定

利用溴百里酚藍（BTB）作為指示劑，通過比色的方法能較為簡單地檢測出金針菇的退化菌種，且其檢測效果比較顯著[12]。林清泉等[13]將該方法用于蛹蟲草菌種的測定中，發現退化菌種與正常菌種經培養后顯示不同的顏色，退化菌株對合成染料BTB的脫色能力明顯低于正常菌株，在脫色率上也表現出差異，且菌液顏色、脫色率與pH密切相關，在pH調節能力方面正常菌株強于退化菌株，呈現出較淺的顏色和較高的脫色率，表明該方法可以作為快速鑒定蛹蟲草退化菌株與正常菌株的檢測手段。

2.2 脫氫酶活性測定

由于脫氫酶的活性可以顯示出細胞活性的強弱，林清泉等[13]測定了不同蛹蟲草菌種的脫氫酶活性，結果發現，正常狀態下蛹蟲草菌種的酶活性高于退化菌種的活性，且在所測定的蛹蟲草菌種中，正常菌種能形成正常的蛹蟲草子實體而退化菌種不能形成正常的子實體，這與脫氫酶活性的測定結果一致。黃春花等[14]對蛹蟲草TTC-脫氫酶測定的條件進行了改良，使用培養6 d之后的蛹蟲草菌液經4次生理鹽水洗滌后，配制成0.15 g/mL的待用菌液；反應緩沖液是Tris-HCl，最適宜pH是8.4；最適反應溫度是37 ℃、最適反應時間是3 h；酶促反應完成后及時把樣品放置冰上，在4 ℃溫度下離心后再用無菌水洗2次，用無水乙醇萃取后便可測定其吸光度，得到脫氫酶活性。因此，脫氫酶活性可以提早檢測出退化的菌種，避免大規模培養過程中退化菌種的誤用導致產生損失。

3 遺傳背景因素

3.1 核相

有研究表明，蛹蟲草核相發生了改變（異核體變成了同核體）會導致其菌種的退化，不能正常形成子實體[10，15]。正常的蛹蟲草菌種是含有兩類交配型基因的異核體，而退化的菌種是只含有其中一類交配型基因的同核體，只有當可親和的初生同核菌絲體之間發生質配后，形成含有兩類交配型基因的異核體，才能具備產生子實體的能力[10，15]。

3.2 基因突變

菌種的退化許多是由于基因突變引起的。使用PCR-RFLP與RAPD的方法，李美娜等[10，16]對野生蛹蟲草及其退化菌種的基因進行了分析，結果顯示，在5.8S+ITS區段，正常蛹蟲草菌種和退化菌種最少有2個位點有差異，且退化菌種在第279和第360個堿基處發生了T到C的堿基點突變，所產生的這些突變很有可能與蛹蟲草菌種退化的基因相關。

3.3 活性氧

蛹蟲草菌種的退化也可能是受到活性氧與其引導的氧化應激的影響，活性氧是引起細胞凋亡的信使因子與效應因子，當蛹蟲草機體處在氧化應激狀態時，其細胞中的活性氧含量就會提高，蛹蟲草機體就會處在易損狀態，同時能使致病因素的毒性作用增強，可引起基因突變[17]。熊承慧等[18]克隆了來自構巢曲霉的谷胱甘肽過氧化物酶基因，通過真菌轉化方法分別轉化到已經退化菌種ZYF和能夠正常結實的菌種CM01中進行過量表達，能夠使已經退化的蛹蟲草菌種恢復產生子實體的能力，而正常的蛹蟲草菌種可以在繼代培養過程中保持其性狀的相對穩定，表明清除真菌細胞內的活性氧能夠減緩其氧化脅迫水平，從而改善蛹蟲草菌種退化的現象。

4 外界培養因素

4.1 蛹蟲草菌種的保藏

在人工栽培的過程中，對蛹蟲草菌種的保藏一般用低溫試管菌種進行保藏，但通常半年后菌種就發生了退化，不產子實體或產生少量畸形子實體。有研究表明，保藏時間的長短與蛹蟲草菌種的退化有一定的關系，保藏時間在30 d內的蛹蟲草菌種的性狀較為穩定，基本沒有退化；保藏60 d后的菌種在栽培后，其性狀表現出明顯的差異，隨著保藏時間的延長其退化的程度逐漸加劇[19]。蛹蟲草菌種的保藏溫度也會影響其退化的速度，溫度高其退化的速度就快，反之，溫度低蛹蟲草菌種退化慢，其保藏的時間也可相應延長。采用4 ℃恒溫保藏的時間沒有進行溫差保藏（白天10 ℃與晚上5 ℃）的時間長，有少量散射光的保藏條件比黑暗保藏條件更有利于蛹蟲草菌種的保藏。

4.2 無性繁殖的轉管次數

在大規模生產中，為了降低生產成本，最常用的做法就是采用轉管傳代的方法來生產蛹蟲草蟲草菌種，實際證明蛹蟲草菌種轉管傳代超過3次以上，菌絲生長速度會下降，見光轉色能力會變差，子實體的產量明顯下降直至不產子實體[20]。因此，在生產和試驗中必須注明菌種的繁殖代數，以免生產上出現不必要的損失[21]。

5 退化菌種的復壯

由于蛹蟲草在人工栽培過程中使用的菌種很容易就退化了，故很難對已經退化的菌種進行直接復壯。西南林業大學生命科學學院實驗室嘗試了改善其營養方式的方法進行復壯，雖然適當含量的氮源和亞硒酸鈉對蛹蟲草子實體的產生有很好的促進作用，但并不能改善退化菌種的退化性狀。因此，蛹蟲草的復壯通常是可通過野外重新采集、生產選育來解決的[22]，其方法主要有組織分離法、孢子分離法、蟲體回接法[8，23]。

6 展望

蛹蟲草的人工栽培進入了產業化，市場對蛹蟲草子實體的需求也極大地增加了，但生產中蛹蟲草菌種退化極快，子實體質量不穩定；蛹蟲草有很高的食藥用價值，不少研究在篩選優良菌種，利用其菌絲生產其藥性成分，但優良菌種極易退化。因此，有效地解決蛹蟲草菌種的退化問題迫在眉睫。建立完善不易退化的蛹蟲草菌種選育體系，有利于蛹蟲草的生產實踐。要從根本上解決退化問題，還是要研究蛹蟲草的退化機理，可以結合其生長和代謝的相關基因進行研究，也可以對蛹蟲草退化的代謝組和轉錄組進行研究。

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