環孢素A對大鼠重癥急性胰腺炎早期損傷和炎癥反應的影響*

蘆靈軍　李天永　陳曉理　黃君　謝明均

(1.宜賓市第一人民醫院，四川 宜賓 644000；2.四川大學華西醫院普外科，四川 成都 610041)

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環孢素A對大鼠重癥急性胰腺炎早期損傷和炎癥反應的影響*

蘆靈軍1李天永1陳曉理2黃君1謝明均1

(1.宜賓市第一人民醫院，四川 宜賓 644000；2.四川大學華西醫院普外科，四川 成都 610041)

【摘要】目的觀察環孢素A對大鼠重癥急性胰腺炎早期損傷和炎癥反應的影響。方法將40只SD大鼠隨機分為對照組(n=8)、重癥急性胰腺炎組(n=16)和環孢素A組(n=16)。采用3.3%牛磺膽酸鈉膽管注射法制備大鼠重癥急性胰腺炎模型，環孢素A組在重癥急性胰腺炎制模成功后40 min再經腹腔注射環孢素A (50mg/kg)。重癥急性胰腺炎組和環孢素A組大鼠各分為6 h和24 h兩個亞組，對照組大鼠于24 h時處死。抽取下腔靜脈血測定血淀粉酶和C-反應蛋白，留取胰腺組織觀察組織形態學變化并進行病理評分，通過免疫組化檢測胰腺組織NF-κB p65 的表達。結果重癥胰腺炎組血淀粉酶、C反應蛋白、胰腺病理評分和NF-κB p65 的表達均較對照組升高，并隨時間延長而進一步升高(P<0.01)；同時間段環孢素A組與重癥胰腺炎組相比，血淀粉酶、C反應蛋白、胰腺病理評分和NF-κBp65 的表達均降低(P<0.01)。NF-κBp65 的表達與胰腺病理評分正相關(r=0.982,P<0.01)。結論環孢素A可明顯減輕大鼠重癥急性胰腺炎早期胰腺損傷和炎癥反應程度，其機制可能與抑制NF-κB 的表達有關。

【關鍵詞】環孢素A；早期重癥急性胰腺炎；實驗研究；病理評分；免疫組化

急性胰腺炎是一種常見的急腹癥。盡管在治療上有一定進展，但重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)死亡率仍高達10%～30%[1]。炎性細胞和因子的過度活化在急性胰腺炎早期的發展中起重要作用，然而以細胞因子為基礎的臨床試驗卻令人失望[2]。炎癥反應涉及許多因素和細胞，只針對某些因素或細胞可能無法終止整個活動過度的炎性反應，調節免疫炎性細胞的活性是一種新的嘗試。先期的動物實驗研究表明[3]，傳統的免疫抑制劑環磷酰胺或甲氨蝶呤通過降低炎性細胞因子和抗炎細胞因子水平，使炎癥反應維持在較低的活化狀態，緩解SAP的疾病進展。本研究通過建立動物模型，觀察新型免疫抑制劑環孢素A(cyclosporin A,CsA)對SAP的損傷和炎癥反應的影響，為臨床治療提供新的理論依據和實驗基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料環孢素A注射液由瑞士諾華制藥有限公司生產。牛磺膽酸鈉(5g T0808)購自日本東京化成工業株式會社。大鼠C反應蛋白ELISA試劑盒購自上海凱博生化試劑有限公司。NF-κB p65大鼠單克隆抗體購自Abcam公司。健康6～7周齡雌性SD大鼠40只，體重180～250g，清潔級，由成都達碩動物實驗有限公司提供。實驗動物及實驗使用條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》。手術及實驗操作主要在四川大學華西醫院移植免疫實驗室完成，胰淀粉酶以及C反應蛋白檢測由成都中醫藥物評價中心檢測完成，病理切片制作在四川大學華西醫院病理研究室完成。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組與處理將健康雌性SD 大鼠40 只隨機分為3 組：對照組(n=8)、SAP組(n=16)和CsA組(n=16)。大鼠術前12 h 禁食，自由飲水。對照組開腹后僅翻動胰腺；SAP組開腹后顯露胰膽管，胰管穿刺針在乳頭下端0.5cm處的無血管區穿刺針進入十二指腸，穿刺針順利進入胰膽管后勻速注入3.3%牛磺膽酸鈉2ml/kg，注射時間控制在60s左右；CsA組在重癥胰腺炎制模成功后40 min再經腹腔注射環孢素A (50mg/kg)。SAP組和CsA組分別于術后6h和24h各處死8只大鼠，對照組大鼠于術后24h處死。予以3%戊巴比妥鈉經腹腔注射麻醉，抽取下腔靜脈血測定血淀粉酶和C-反應蛋白，處死大鼠后留取胰腺組織經10%的甲醛固定。

1.2.2指標檢測①血淀粉酶用全自動生化分析儀檢測。②C反應蛋白的測定采用ELISA 法按照試劑盒說明書進行。③胰腺組織病理形態學檢測：胰腺組織常規石蠟包埋、HE染色后光學顯微鏡檢查，每張切片觀察5個高倍視野，按照schmidt標準[4]進行病理學評分。④Envision二步法檢測胰腺組織NF-κB p65 的表達：按Envision試劑盒說明操作，切片常規脫蠟，微波修復抗原，過氧化氫避光封閉10min，將NF-κB抗體工作液滴加到組織切片上， 4℃孵育過夜，雙蒸水洗3次換washbuffer，將HRP Rabbit/Mouse 檢測二抗工作液滴加到組織切片上，37℃孵育40min，DAB顯色，蘇木素復染，中性快干樹膠封片。每張切片隨機觀察5個高倍視野，以半定量積分法描述NF-κB p65染色情況[5]。染色強度按陰性染色、弱陽性染色、中度陽性染色、強陽性染色依次記0～3分，染色范圍按陽性細胞占總細胞數比例<10%記0分，11%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分，每張切片染色強度和染色范圍所得分相加為最后得分。組織病理學和免疫組化指標檢測由病理科醫師盲法進行。

2結果

2.1血淀粉酶和C反應蛋白的變化各組大鼠之間血淀粉酶和C反應蛋白水平比較，差異有統計學意義(F=134.053，P<0.01；F=135.441，P<0.01)。SAP大鼠各時點的血淀粉酶和C反應蛋白水平較對照組上升(P<0.01)，并隨時間的延長而進一步升高(P<0.01)；與同時間點的SAP組相比，CsA組大鼠血淀粉酶和C反應蛋白水平均降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1各組大鼠不同時間點血淀粉酶和C反應蛋白的比較

Table 1Comparison of blood amylase and C-reactive protein at different time points in different group of rats

組別n血淀粉酶(U/L)C反應蛋白(mg/L)對照組8889.33±87.170.13±0.02SAP組 6h83254.61±437.441.88±0.32 24h85106.98±581.252.24±0.23CsA組 6h82377.55±411.53①0.70±0.07① 24h84475.74±367.87①1.10±0.24①F134.053135.441P<0.01<0.01

注：CsA組與同時點SAP相比，①P<0.01

2.2各組大鼠胰腺組織病理學比較對照組大鼠胰腺小葉結構清晰，偶見少量炎細胞浸潤。SAP-6h大鼠胰腺間質水腫較明顯，血管充血，可見散在出血，部分胰腺上皮細胞變性、壞死伴較多炎細胞浸潤；CsA-6h大鼠間質水腫減弱，出血不明顯，胰腺上皮細胞變性、壞死區域減小，炎細胞浸潤減少；SAP-24h大鼠胰腺間質廣泛水腫，間質微血管破裂出血，胰腺壞死明顯較廣泛，部分腺泡結構紊亂，大量炎細胞浸潤，以嗜中性粒細胞為主；CsA-24h大鼠間質水腫明顯，間質微血管有破裂，胰腺變性壞死較明顯，腺泡結構尚未破壞，炎細胞浸潤仍比較明顯，灶性區域可見淋巴細胞，見圖1。

圖1各組大鼠胰腺組織病理學改變的比較(10×10倍)

Figure 1Comparison of pathological changes of pancreas in different group of rats

對照組大鼠胰腺組織病理評分(0.38±0.44)，SAP-6h評分(7.69±0.88)，CsA-6h評分(6.31±0.70)，SAP-24h 評分(12.13±0.95)，CsA-24h評分(10.63±0.83)。各組之間病理評分比較，差異有統計學意義(F=270.550，P<0.01)。SAP大鼠各時點的病理評分較對照組上升(P<0.01)，并隨時間的延長而進一步升高(P<0.01)；CsA組較同時點的SAP組大鼠病理評分降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3各組大鼠胰腺NF-κB p65的表達情況對照組大鼠胰腺中NF-κB p65基本無陽性表達，SAP-6h 時NF-κB p65的表達主要位于胰腺腺泡的胞漿，呈淺黃色或黃色，陽性細胞率約25%～50%；SAP-24h 時NF-κB p65的表達主要位于胰腺腺泡的胞漿和胞核，呈黃色或棕黃色，陽性細胞率在50%以上；CsA組大鼠NF-κB p65的表達與SAP組對應時點相比免疫陽性細胞減少，著色減弱，見圖2。

圖2各組大鼠胰腺組織NF-κB p65表達的比較

Figure 2Comparison of NF-κB p65 expression of pancreas in different group of rats

對照組大鼠NF-κB p65免疫組化評分(0.25±0.46)，SAP-6h評分(3.88±0.83)，CsA-6h評分(2.88±0.64)，SAP-24h 評分(5.88±0.64)，CsA-24h評分(4.25±0.71)。各組之間評分比較，差異有統計學意義(F=77.364，P<0.01)。SAP大鼠各時點的免疫組化評分較對照組上升(P<0.01)，并隨時間的延長而進一步升高(P<0.01)；CsA組免疫組化評分較同時點的SAP組降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

2.4相關性分析結果血淀粉酶與病理評分呈正相關(r=0.987，P=0.002)，NF-κB p65表達與病理評分呈正相關(r=0.982，P=0.003)，C反應蛋白水平與病理評分不相關(P=0.090)。

表2各組大鼠不同時間點組織病理學評分和免疫組化評分的比較

Table.1Comparison of histopathological grading and immunohistochemical score at different time points in different group of rats

組別n組織病理學評分免疫組化評分對照組80.38±0.440.25±0.46SAP組 6h87.69±0.883.88±0.83 24h812.13±0.955.88±0.64CsA組 6h86.31±0.70①2.88±0.64① 24h810.63±0.83①4.25±0.71①F270.55077.364P<0.01<0.01

注：CsA組與同時間點SAP相比，①P<0.01

3討論

急性胰腺炎是多種因素導致胰酶激活引起胰腺組織自身消化而水腫、出血甚至壞死的炎性反應。近期來的研究表明，免疫功能紊亂在SAP發病機制中的作用受到廣泛關注，免疫炎性細胞及其因子和介質的協同作用在急性胰腺炎導致的全身性炎癥中起重要作用。在SAP初始階段，胰蛋白酶激活，腺泡細胞破壞引起胰腺自身消化，造成胰腺局部的炎癥反應。早期過度的炎性細胞及其釋放的大量介質，激發難以控制的炎癥級聯反應，引起機體過強的炎癥免疫反應，促使炎癥擴散，造成重要臟器繼發性損傷，導致全身炎性反應綜合征、多器官功能障礙乃至死亡[6-8]。

SAP早期以免疫過激為主，傳統的免疫抑制治療可以減輕炎癥反應，減輕對機體的損傷。在臨床上5-氟尿嘧啶可用于治療急性胰腺炎，最早認為其作用機理是抑制胰蛋白酶的分泌。而此后的實驗研究發現，5-氟尿嘧啶、糖皮質激素、環磷酰胺、甲氨蝶呤等免疫抑制藥物可以同時降低SAP的炎性細胞因子和抗炎細胞因子水平，適度降低早期過高的免疫過激，降低胰淀粉酶水平和胰腺濕重，緩解疾病進展。本研究建立SAP模型后用環孢素A進行干預，檢測不同時點大鼠血淀粉酶和C反應蛋白水平，胰腺病理評分評價組織損傷程度，探討新型T淋巴細胞功能調節劑環孢素A在SAP早期損傷和炎癥反應過程中的作用。血淀粉酶是臨床診斷急性胰腺炎的常用指標，在一定程度上反映病情的嚴重程度。C反應蛋白作為肝臟合成的急性時相蛋白，直接參與了炎癥過程，是一個有價值的預后評價指標，可早期評估急性胰腺炎的嚴重程度[9-12]。胰腺病理評分從水腫、出血、壞死及炎癥細胞浸潤等4個方面綜合評價胰腺的損傷程度。本研究結果顯示SAP大鼠在6h時點血淀粉酶和C反應蛋白水平就明顯升高，組織病理學上有較為明顯的胰腺損傷表現，24h時點血淀粉酶和C反應蛋白水平進一步升高，組織病理學上胰腺損傷表現也更加突出，胰腺炎的損傷程度隨時間延長而進一步加重。相同時點的CsA組與SAP組相比，無論是血淀粉酶和C反應蛋白水平，還是組織病理學評分，都有顯著性改善，表明環孢素A可以減輕SAP早期大鼠胰腺損傷和炎癥反應程度，緩解疾病進展。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內的核轉錄因子，起初是從B淋巴細胞核中提取，主要參與調節胚胎發育、機體炎癥、組織損傷和修復等相關的基因表達[13-14]。近年來NF-κB在急性胰腺炎發病機制中的作用越來越受到重視。發病初期，局部炎癥可通過NF-κB介導多種炎性細胞因子激活，觸發炎癥介質“瀑布樣級聯反應”，使急性胰腺炎從局部病變發展為全身炎癥反應綜合征和多器官功能衰竭[15-16]。NF-κB作為主要參與炎性分子表達調控的核轉錄因子，通常以二聚體形式存在，并與胞質內的抑制因子(I-κB)蛋白結合。當受到炎性刺激時以活化狀態向核內轉移，調控炎癥相關基因的轉錄和表達。有證據表明[17-18]，急性胰腺炎早期NF-κB的活化與細胞內胰蛋白酶原激活同時發生，是兩大獨立的早期事件。胰蛋白酶原激活造成早期腺泡細胞損傷，但急性胰腺炎早期強烈的炎癥反應是由NF-κB活化來誘導的[19-20]，NF-κB在誘導和控制免疫炎癥反應中細胞因子的基因表達中起關鍵作用[21]。本研究結果顯示SAP大鼠在6h時點胰腺腺泡的胞漿中NF-κB p65就有表達，呈淺黃色或黃色，24h時點胞漿和胞核都有表達，陽性細胞數增加，染色加深，說明急性胰腺炎的病情嚴重程度與NF-κB的表達密切相關；對應時點CsA組大鼠NF-κB p65的表達與SAP組相比免疫陽性細胞減少，免疫組化評分下降，表明環孢素A可以通過減輕NF-κB 的過度活化，減少其介導的多種炎性細胞因子激活，減輕大鼠胰腺損傷和炎癥反應程度。NF-κB p65 的表達與胰腺病理評分相關性分析顯示兩者之間存在正相關，表明環孢素A對SAP早期的保護作用與減輕NF-κB 的過度活化有關。

4結論

環孢素A作為鈣調磷酸酶抑制劑類藥物，主要通過特異性地抑制輔助性T淋巴細胞的活性發揮免疫抑制作用。在SAP早期過激的免疫炎癥反應加重了胰腺的損傷，而早期應用環孢素A干預后血清淀粉酶和C反應蛋白降低，可使胰腺病理評分得以改善，本文研究結果表明環孢素A能明顯減輕大鼠重癥急性胰腺炎早期胰腺損傷和炎癥反應程度，其機制可能與抑制NF-κB 的表達有關。

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基金項目：四川省衛生廳科研課題(100589)

通訊作者：陳曉理，Email:zean_z@yahoo.com.cn

【中圖分類號】R 657.5+1

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.006

(收稿日期：2015-12-01；編輯：陳舟貴)

Effect of cyclosporine A on injury and inflammation in rats with early severe acute pancreatitis

LU Lingjun1,CHEN Xiaoli2,LI Tianyong1,et al

(1.Department of General Surgery,The First People’s Hospital of Yibin,Yibin 644000,Sichuan,China;2.Department of General Surgery,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of cyclosporine A on injury and inflammation in rats with early severe acute pancreatitis.Methods40 rats were divided randomly into the control group (n=8),severe acute pancreatitis (SAP) group (n=16) and Cyclosporine A (CsA) group (n=16).The rat of SAP group was induced by bile duct injection with 3.3% taurocholic acid.In the CsA group,50 mg/kg of CsA was injected intraperitonealy 40 minutes after SAP was induced.SAP group and CsA group were divided into 6 h and 24 h subgroup respectively,and the rat of control group was sacrificed 24 hours after operation.Serum amylase and C- reactive protein were measured by extracting the inferior vena venous blood,morphological changes and pathological score of pancreatic were observed,and the expression of NF-κB p65 in pancreatic tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsSerum amylase,C- reactive protein,pathological score and expression of NF-κB p65 in SAP group increased compared with the control group,and further increased with time(P<0.01).Compared with that of the SAP group on the same time point,serum amylase,C- reactive protein,pathological score and expression of NF-κB p65 decreased significantly(P<0.01).The expression of NF-κB p65 was positively correlated to pancreatic pathological score(r=0.982,P<0.01).ConclusionCyclosporine A can relieve the pancreatic injury and inflammation in rats with early severe acute pancreatitis,and the mechanism may be relate to inhibiting the expression of NF-κB.

【Key words】Cyclosporine A; Early severe acute panccretitis; Experimental research; Pathological score; Immunohistochemistry