慢性乙型肝炎前C區G1896A基因變異對HBV復制及疾病嚴重程度的影響

瞿衛東　胡晨波　方敏　朱君效

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慢性乙型肝炎前C區G1896A基因變異對HBV復制及疾病嚴重程度的影響

瞿衛東胡晨波方敏朱君效

201399 上海市浦東新區南華醫院肝病科(胡晨波)；浦東新區書院社區衛生服務中心(瞿衛東、方敏)；浦東新區航頭社區衛生服務中心(朱君效)

【摘要】目的研究乙型肝炎病毒(HBV)前C區G1896A變異對乙型肝炎病毒復制及疾病嚴重程度的影響。方法選取43例慢性乙型肝炎及49例乙型肝炎肝硬化患者為研究對象。采用PCR技術檢測HBV前C區G1896A位點變異及乙型肝炎基因分型。同時檢測HBeAg、HBV DNA定量、肝功能血清生化指標。結果(1)發生HBV前C區G1896A變異患者的年齡大于野生株感染者(P<0.01)，發生肝硬化的可能性更大(P<0.01)。(2)隨著變異株感染率的增加，HBeAg陰性率較野生株組增加(P<0.01)，基因C型較野生株組增加(P<0.05)，HBV DNA水平降低差異意義(P>0.05)。結論HBV前C區G1896A變異與HBeAg的狀態，HBV DNA的復制及疾病嚴重程度相關。

【關鍵詞】前C區G1896A；基因變異；乙型肝炎病毒；復制

HBV感染是全球病毒性肝炎的主要原因之一。HBV是部分雙鏈DNA，全長3.2 kb。HBV含4個部分重疊的開放讀碼框(ORF)，即前-S/S區、前-C/C區、P區和X區。前-S/S區編碼大(前-S1、前-S2及S)、中(前-S2及S)、小(S)3種包膜蛋白，前-C/C區編碼HBeAg及HBcAg，P區編碼聚合酶，X區編碼X蛋白。前C(Precore，PC)區G1896A位點變異和基本核心啟動子(BCP)區A1762T/G1764A變異是HBeAg陰性的慢性乙型肝炎相關的兩種HBV變異的主要類型。G1896A變異可使HBV PC區第28位密碼子由色氨酸變為終止密碼子，從而阻斷了HBeAg的產生，而HBV復制和HBcAg表達并不受此影響[1]。PC區變異與體內病毒間歇性和持續性復制相關[2]。

為此，本研究選取43例慢性乙型肝炎及49例乙型肝炎肝硬化患者進行分析，探討HBV PC區G1896A變異對慢性乙型肝炎病毒復制及疾病嚴重程度的影響。

資料和方法

一、研究對象

2013年1月至2015年6月上海市浦東新區南華醫院肝病科住院的HBsAg陽性慢性乙型肝炎患者92例，男81例，女11例。慢性乙型肝炎及肝硬化的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》診斷標準[3]；且所有患者血清HBV DNA>103拷貝/mL。所有患者同時排除其他病毒感染及重疊其他病毒引起的肝炎，藥物性、酒精性、自身免疫性和代謝性肝病，伴有其他器官損害。清晨空腹抽血，分離血清，-40℃保存備用，統一進行檢測。

二、實驗室檢測

抽血前1 d禁食8 h后，次日晨空腹抽血。采用日本東芝120全自動生物化學分析儀檢測肝功能生化指標。PCR法檢測血清HBV DNA，采用美國Bio Rad公司的CF-X96型熒光定量PCR儀及中山大學達安基因股份有限公司的HBV DNA熒光定量檢測試劑盒，檢測范圍為102～108拷貝/mL。 HBV PC G1896A變異檢測采用PCR加膜雜交法檢測，S1000基因擴增儀，深圳亞能生物試劑。以上檢測操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

三、統計學方法

結果

一、一般情況

納入的92例患者(43例慢性乙型肝炎及49例乙型肝炎肝硬化)中男81例，女11例，平均年齡(31.27±11.9)歲；ALT (199.40±26.32) U/L；Alb(34.40±0.68) g/L；HA (35.92±40.36) ng/L。

HBV PC區G1896A變異野生株和部分變異株、完全變異株性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。部分及完全變異株與野生株年齡比較，差異有統計學意義(P均<0.01)。部分及完全變異株與野生株ALT比較，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。部分及完全變異株與野生株Alb比較，差異有統計學意義(P均<0.01)。部分及完全變異株與野生株HA比較，差異有統計學意義(P均<0.01)。見表1。

二、HBV PC區G1896A變異野生株、部分變異株、完全變異株與HBeAg、HBV DNA、基因型的關系。

野生株和部分變異株、完全變異株HBeAg陽性率(90.90%，37.50%，5.26%)比較，差異有統計學意義(P<0.01)。野生株和部分變異株、完全變異株基因C型比較(54.55%、84.38%、84.21%)，差異有統計學意義(P<0.05)。野生株和部分變異株、完全變異株HBV DNA≥6 lg拷貝/mL(68.18%、78.13%、60.53%)，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　HBV PC區G1896A變異與HBeAg、

三、HBV PC區G1896A變異野生株、部分變異株、完全變異株與肝臟疾病嚴重程度的關系

野生株和部分變異株、完全變異株慢性肝炎率(72.73%，46.88%，31.58%)、肝硬化率(27.27%、53.13%、68.42%)比較，差異有統計學意義(P均<0.01)。見表3。

表3　HBV PC區G1896A變異野生株、部分變異株、完全變異株疾病程度比較[例(%)]

討論

HBV DNA復制通過核糖核酸(RNA)中間體逆轉錄，由于其逆轉錄缺乏校對功能，因此HBV DNA復制出現錯誤的頻率較其他DNA病毒高得多。HBV發生自然變異最常見的是PC區，其高頻率地發生及穩定的表型提示這些變異可能會提高HBV復制或逃避宿主免疫反應。目前發現G1896A變異是PC區最常見，也是最重要的變異。

HBV感染的自然史一般可人為劃分為4個期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低(非)復制期及再活動期。在HBV感染的中后期，患者針對HBV感染的免疫一定程度上增強，伴隨著HBeAg的血清學轉換，HBV PC和BCP變異株替代野生株成為優勢株[4]。Yan等[5]報道PC或BCP變異在HBeAg陽性患者中為(125/192)65.1%，提示在HBV感染的不同階段，PC/BCP變異的程度不同。本研究顯示，隨著患者年齡增加，PC變異的程度逐漸增加，差異有統計學意義(P<0.01)。

HBV PC區G1896A變異還可以對宿主的免疫產生影響。Moradzadeh M等[6]研究顯示，HBV PC區G1896A發生突變的患者的Toll樣受體2(TLR2)水平較野生株患者增高，由于TLR2是介導炎癥的重要因子，所以PC區G1896A發生突變的慢性乙型肝炎患者的ALT水平較野生株高。本研究顯示，HBV PC區G1896A變異野生株ALT高于部分變異株、完全變異株，差異有統計學意義(P<0.05)，分析原因肝硬化患者在部分(53.13%)及完全(68.42%)變異株組比野生株組(27.27%)明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)，而肝硬化患者由于存在功能的肝細胞明顯降低，故ALT升高不明顯。另外，部分及完全變異株組與野生株組Alb比較，差異有統計學意義(P<0.05)；部分及完全變異株組與野生株組HA比較，差異有統計學意義(P<0.01)。這均提示隨著HBV PC區G1896A變異的增加，患者肝臟疾病嚴重程度逐漸加重，發生肝硬化的風險增加。近期有文獻同樣認為，結合log10PC、log10BCP、PC% 和BCP%的動態變化可以評估肝臟疾病的進展程度[7]。另外，Tong MJ等[8]研究表明，HBV PC、BCP變異可以顯著增加慢性乙型肝炎患者原發性肝癌的風險。

表1　HBV PC區G1896A變異不同程度患者的臨床和實驗室參數比較(±s)

注：*P<0.05；**P<0.01

目前關于HBV DNA和疾病進展的最大數據來自于REVEAL研究，這是一項評估慢性乙型肝炎自然史的大樣本、前瞻性隊列研究。該研究表明血清HBV DNA水平是慢性乙型肝炎發生肝硬化或肝癌的重要、獨立危險因素[9]。PC區終止密碼子變異G1896A導致前C蛋白表達障礙，減弱前C蛋白對HBV病毒復制的抑制，從而加強了pgRNA衣殼化，導致病毒復制增加[10]。本研究中部分及完全變異株組HBeAg陽性率明顯降低(P<0.05)，但HBV DNA較野生株組差異無統計學意義 (P>0.05)。

根據乙型肝炎病毒基因組測序，以乙型肝炎病毒基因組至少有8%的差異，將HBV分為10個基因型(A～J)[11]。我國以B、C型為主。HBV 基因C型比基因B型與嚴重肝病、肝硬化和原發性肝癌更相關，而基因D型發生相關的嚴重肝病或原發性肝癌比基因A型更相關[12]。這可能是因為PC區G1896A變異在HBV基因D型變異頻率最高，在基因B，C和E型較高，但在基因A，F和H型幾乎不發生[13]。這種特定HBV基因型的限制與需要保持前基因組干-袢結構中的衣殼信號相關。本研究表明，PC區G1896A發生突變的患者中基因C型較野生株組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。

總之，HBV的PC區基因變異可能具有重要的臨床意義。這些變異株可能會增加肝硬化、肝癌發生的風險，影響HBV DNA復制的能力，并可能會導致在HBeAg消失后HBV DNA仍能持久復制。

參考文獻

[ 1 ]Choi JW, Ahn SH, Park JY, et al. Hepatitis B e antigen-negative mutations in the precore and core promoter regions in Korean patients. J Med Virol，2009, 81:594-601．

[ 2 ]Biswas A, Banerjee A, Chandra PK, et al. Variations in the functional domain of basal core promoter of hepatitis B virus among Eastern Indian patients with prevalence of genotypes A, C, and D among the same ethnic population. J Med Virol, 2011, 83:253-260.

[ 3 ]中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)．中國病毒病雜志，2011，9-23．

[ 4 ]Tong S, Kim KH, Chante C, et al. Hepatitis B Virus e AntigenVariants. Int J Med Sci, 2005, 2:2-7.

[ 5 ]Yan CH, Zhao CY, Ding H, et al. Hepatitis B virus basal core promoter mutations A1762T/G1764A are associated with genotype C and a low serum HBsAg level in chronically-infected HBeAg-positive Chinese patients. Antiviral Res, 2012, 96:108-114.

[ 6 ]Moradzadeh M, Tayebi S, Poustchi H, et al. The Possible Role of TLR2 in Chronic Hepatitis B Patients with Precore Mutation. Adv Virol, 2013, 2013:780319.

[ 7 ]Tu WH, Lv Y, Zhang YM, et al. Precore/basal core promoter mutants quantification throughout phases of hepatitis B virus infection by Simpleprobe. World J Gastroenterol, 2015, 21: 6639-6648.

[ 8 ]Tong MJ, Blatt LM, Kao JH, et al. Basal core promoter T1762/A1764 and precore A1896 gene mutations in hepatitis B surface antigen-positive hepatocellular carcinoma: a comparison with chronic carriers. Liver Int, 2007, 27:1356-1363.

[ 9 ]Chen CJ, Yang HI, lloeje UH; REVEAL-HBV Study Group. Hepatitis B virus DNA levels and outcomes in chronic hepatitis B. Hepatology, 2009, 49(5 Suppl): S72-84.

[10]Scaglioni PP, Melegari M, Wands JR, et al. Biologic properities of hepatitis B viral genomes with mutations in the precore promoter and precore open reading frame. Virology, 1997, 233:374-381.

[11]Liu CJ, Kao JH. Global perspective on the natural history of chronic hepatitis B: role of hepatitis B virus genotypes A to J. Semin Liver Dis, 2013, 33:97-102.

[12]El-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 2012, 142:1264-1273.

[13]Kramvis A, Arakawa K, Yu MC, et al. Relationship of serological subtype, basic core promoter and precore mutations to genotypes/subgenotypes of hepatitis B virus. J Med Virol, 2008, 80:27-46.

(本文編輯：賴榮陶)

基金項目：浦東新區衛生系統優秀青年醫學人才培養(PWRq2012-05)；浦東新區衛生系統重點全科團隊建設資助(PWZq2013-03)

通信作者：朱君效，Email： judymama@foxmail.com

(收稿日期：2015-12-03)

·臨床與基礎研究·

共同第一作者：胡晨波