非諾貝特對實驗性糖尿病大鼠早期視網膜病變的影響

關清華，曠勁松，趙玉蓉，程　嵐，張秀彬

(遼寧省沈陽市第四人民醫院，遼寧 沈陽110031)

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非諾貝特對實驗性糖尿病大鼠早期視網膜病變的影響

關清華，曠勁松，趙玉蓉，程嵐，張秀彬

(遼寧省沈陽市第四人民醫院，遼寧 沈陽110031)

[摘要]目的觀察非諾貝特對早期糖尿病性視網膜病變(DR)大鼠視網膜組織血管內皮生長因子(VEGF)、蛋白激酶C(PKC)表達及細胞凋亡的影響,探討非諾貝特防治早期DR的作用機制。方法將實驗用封閉群4周雄性健康SD大鼠50只隨機分成正常組(10只)、糖尿病組(20只)和非諾貝特組(20只)。非諾貝特組和糖尿病組均采用鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射制作糖尿病模型。非諾貝特組每天給予非諾貝特10 mg/kg與飼料混合后喂養，糖尿病組與正常組給予普通飼料喂養。記錄給藥前及給藥4，8，12，16周時3組空腹血糖水平。給藥16周后處死大鼠，取眼球，制作視網膜組織切片，采用免疫組織化學染色法檢測VEGF和PKC蛋白表達情況，采用原位末端脫氧核糖核苷酸轉移酶標記技術(TUNEL)檢測細胞凋亡情況。結果給藥4，8，12，16周非諾貝特組和糖尿病組空腹血糖水平均顯著高于正常組(P均<0.05)，但2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。給藥16周后3組大鼠視網膜VEGF和PKC蛋白表達水平比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，其中糖尿病組與非諾貝特組大鼠VEGF和PKC蛋白表達水平較正常組明顯上調(P均<0.05)，但非諾貝特組較糖尿病組明顯降低(P均<0.05)。非諾貝特組及糖尿病組視網膜組織細胞凋亡指數均明顯高于正常組(P均<0.05)，但非諾貝特組視網膜組織細胞凋亡指數顯著低于糖尿病組(P<0.05)。結論非諾貝特可下調早期糖尿病大鼠視網膜組織中VEGF和PKC表達，減少視網膜組織細胞凋亡，干預早期DR的發生發展。

[關鍵詞]糖尿病視網膜病變；非諾貝特；血管內皮生長因子；蛋白激酶C；細胞凋亡

糖尿病性視網膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，是成人致盲的主要原因，嚴重影響患者的生活質量，其患病率隨著糖尿病病程的延長而增高。從糖尿病發病開始20年內，幾乎所用的1型糖尿病和60%的2型糖尿病都將發展成不同程度的DR[1]。近年來，隨著糖尿病發病率逐漸增高，預計DR發生率將進一步升高。故采取有效方式延緩和治療DR具有重要意義。非諾貝特是PPAR-α受體激動劑，除可調節血脂水平外，有循證醫學表明其能延緩DR進展，可能起到某種特殊作用[1]。本研究觀察了非諾貝特對早期DR大鼠視網膜組織血管內皮生長因子(VEGF)和蛋白激酶C(PKC)蛋白表達的影響，旨在探討非諾貝特防治早期DR的作用機制，現將結果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物及造模實驗用封閉群雄性健康Sprague-Dawley (SD)大鼠50只，鼠齡約4周，體質量80～100 g，中國醫科大學動物中心提供，動物合格證號：SCXK(遼)2013-0001。隨機分成正常組(10只)、糖尿病組(20只)和非諾貝特組(20只)。非諾貝特組和糖尿病組均采用STZ (60 mg/kg, 0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.0)一次性腹腔注射制作糖尿病大鼠模型，正常組注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。3 d后，正常組大鼠空腹血糖均小于5.6 mmol/L，非諾貝特組和糖尿病組各有18只大鼠成模(空腹血糖大于17 mmol/L)。實驗期間各組大鼠自由飲水、攝食混合飼料，非諾貝特組每天給予非諾貝特10 mg/kg與飼料混合后喂養，每4周測1次血糖。其中3只糖尿病模型大鼠于飼養期間死亡，非諾貝特組剩余17只，糖尿病組剩余16只。

1.2眼球標本制作飼養3個月后，過量戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，立即摘除眼球，于4 ℃ 40 g/L多聚甲醛溶液中固定，48 h后流水沖洗,梯度乙醇脫水，在體積分數80%乙醇脫水階段，切除眼前節；常規包埋， 4 μm連續切片，每只眼球取10個面，貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片，行HE染色及免疫組織化學檢測。

1.3免疫組織化學檢測VEGF和PKC蛋白表達染色步驟按免疫組織化學試劑盒說明書進行，采用SP法，DAB顯色，蘇木素復染。光鏡下觀察，以胞質中出現棕黃色或黃色顆粒為陽性，以PBS代替一抗作為陰性對照。采用Biosens Digital Imaging System V1.6高清晰度系統病理圖文分析系統對結果進行半定量分析。每個眼球隨機選取3張切片，每張切片在400倍鏡下隨機選取3個視野，統計選定的圖像所用的陽性信號的光密度值，取平均值。

1.4TUNEL染色法檢測視網膜細胞凋亡情況將取出的新鮮視網膜組織用0.9%的NaCl溶液沖洗干凈后浸泡于10%的多聚甲醛中，石蠟包埋后制成石蠟切片，按免疫組織化學試劑盒說明進行操作，封片后在顯微鏡下進行觀察。使用Image-Pro-Plus 6.0圖文分析系統對圖像進行半定量分析，并觀察其表達部位。

1.5統計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。建模后不同時期3組大鼠空腹血糖的比較采用重復測量數據的方差分析，3組大鼠視網膜組織VEGF、PKC蛋白表達水平及神經節細胞層凋亡細胞數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組大鼠全身情況及血糖水平正常組大鼠毛色白而有光澤，體質量逐月增加，活動靈敏，生長迅速。糖尿病組大鼠出現多尿、多飲、多食及體質量減輕，毛色變黃，活動減少。非諾貝特組大鼠全身癥狀加重程度較糖尿病組輕微。給藥4，8，12，16周時非諾貝特組和糖尿病組空腹血糖水平均顯著高于正常組(P均<0.05)，但2組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.23組大鼠視網膜組織HE染色結果光鏡下正常組視網膜結構層次清晰，排列有序；糖尿病組及非諾貝特組各層結構疏松，細胞間距增大，數目減少，內核層萎縮消失，神經纖維層變薄，糖尿病組表現更為明顯。見圖1～3。

表1　3組大鼠不同時期空腹血糖水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05。

2.33組大鼠視網膜組織中VEGF和PKC蛋白表達及其細胞凋亡指數比較糖尿病組與非諾貝特組大鼠VEGF和PKC蛋白表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，但非諾貝特組水平明顯低于糖尿病組(P均<0.05)。見表2。

圖1　正常組大鼠視網膜組織HE染色表現(SP，×400)

圖2　非諾貝特組大鼠視網膜組織HE染色表現(SP，×400)

圖3　DM組大鼠視網膜組織HE染色表現(SP×400)

組別nVEGFPKC細胞凋亡指數/%正常組1064.19±7.6540.18±5.670.78±0.14非諾貝特組1779.44±4.61①②90.23±4.80①②3.54±0.43①②糖尿病組16112.36±9.72①123.17±11.09①4.32±0.67①F69.75147.2573.31P<0.05<0.05<0.05

注：①與正常組比較，P<0.05；②與糖尿病組比較，P<0.05。

2.43組大鼠視網膜組織細胞凋亡情況正常組大鼠視網膜幾乎未檢測到凋亡細胞，而非諾貝特組和糖尿病組均可見明顯細胞凋亡，非諾貝特組細胞凋亡情況較糖尿病組輕微。見圖4～6。

圖4　正常組大鼠視網膜組織細胞凋亡情況(SP，×400)

3討論

DR作為一種漸進性疾病，可導致不可逆性失明，其發生發展是一個復雜的過程，發病機制尚未完全明了。近年來，對DR發生發展的分子機制有了進一步理解，一般認為VEGF是DR早期病理機制中最為重要和關鍵性的一種細胞因子，其是非增殖性視網膜病變的潛在調控因子，同時是增殖性視網膜病變的主要啟動因子，視網膜組織中VEGF的表達受PKC調控[2-3]。在DR中，VEGF有2個主要的病理生理功能[4]：①VEGF影響了內皮細胞的緊密連接，增加了毛細血管的滲透性，從而引起了液體外滲和視網膜水腫；②VEGF引起視網膜毛細血管中白細胞聚集，導致局部炎癥因子的產生和炎癥細胞通過內皮細胞的遷移，這些都能促進血-視網膜屏障的破壞，導致視網膜功能失調，可引起嚴重的視力損害。DR早期病理改變是基底膜增厚，通透性過高和微動脈瘤形成。這些病理改變隨之而來的是微血管的閉塞，導致視網膜缺血，誘導VEGF的釋放，VEGF是引起內皮細胞增殖、遷移和血管形成的有效促有絲分裂劑，然而在糖尿病視網膜中這些新生血管脆性強，很容易破裂，從而進一步加重DR。PKC是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，最初發現用于維持大腦的長期記憶。高血糖通過多種途徑誘導了二乙酰基甘油的產生，二乙酰基甘油是PKC的生理活化劑，在視網膜中PKC的激活似乎主要是PKC-β的激活。經典的PKC亞型(PKC-β)在視網膜VEGF表達上調中起到重要作用，參與緊密連接的破壞，增加了白細胞停滯，與VEGF協同作用參與了視網膜病變的發生發展。本實驗結果顯示糖尿病組視網膜組織VEGF和PKC蛋白表達水平高于正常組，與文獻[5]報道相符。非諾貝特是臨床常用的調脂藥物之一，可降低血漿中三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平和載脂蛋白B水平，同時由于其使載脂蛋白AⅠ和Ⅱ過度表達，并抑制載脂蛋白CⅢ，故可升高高密度脂蛋白膽固醇水平。FIELD和ACCORD-眼睛研究發現非諾貝特對DR的發生發展的保護效應是不依賴血脂水平的，表明在2型糖尿病中非諾貝特對DR的進展可能起到特殊作用[1]。Lingam等[6]研究表明非諾貝特能抑制VEGF通路，改善視網膜毛細血管滲漏和白細胞停滯。NoonanE等[7]提出非諾貝特可改善炎癥反應，通過抑制血管平滑肌細胞中白細胞介素-1水平而抑制白細胞介素-6表達，還抑制了內皮細胞中腫瘤壞死因子-α誘導的血管細胞黏附分子-1表達和C反應蛋白誘導的單核細胞趨化蛋白-1表達,具有明顯抗炎作用。Wong等[8]指出非諾貝特具有抗氧化作用，它可增強超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性,減少過氧化物的產生，抑制了PKC信號傳導通路的異常激活，從而減少VEGF的產生。Chen等[9]提出非諾貝特的有益效應可被特定PPAR-α拮抗藥阻斷,而且敲除過氧化物酶體增生物激活受體的DR動物模型中觀察不到非諾貝特誘導的VEGF下調和視網膜毛細血管滲漏的減輕。可見，非諾貝特對DR的治療效應依賴于眼組織中藥物靶點的存在，同時證明了這種治療效應通過PPAR-α依賴機制介導。本研究也觀察到非諾貝特組視網膜組織VEGF和PKC蛋白表達水平低于糖尿病組，可以推測非諾貝特可以降低糖尿病視網膜組織中VEGF和PKC蛋白表達水平，從而延緩了DR的發生發展。

圖5　非諾貝特組大鼠視網膜組織細胞凋亡情況(SP，×400)

圖6　糖尿病組大鼠視網膜組織細胞凋亡情況(SP，×400)

本研究觀察到正常組大鼠視網膜幾乎未檢測到細胞凋亡，而非諾貝特組和糖尿病組均可見明顯細胞凋亡，非諾貝特組細胞凋亡情況較糖尿病組輕微；同時半定量分析表明非諾貝特組及糖尿病組細胞凋亡指數高于正常組，但非諾貝特組細胞凋亡指數低于糖尿病組，表明非諾貝特具有減少細胞凋亡作用。楊宏偉等[10]研究表明糖尿病大鼠細胞凋亡主要發生在內層視網膜, 最早于發病4 周時出現在視網膜神經節細胞,數量上呈時間信賴性, 逐漸出現在內核層的雙極細胞、神經膠質細胞及血管內皮細胞、周細胞等；且細胞凋亡的發生遠遠早于視網膜血管的變化, 16周前誘導的糖尿病大鼠視網膜病變仍處于背景期, 已有凋亡機制的參與，從而導致視力損傷。非諾貝特具有延長視網膜內皮細胞存活及減少凋亡效應[7-11],本研究結果與此相符。非諾貝特減少細胞凋亡的效應很可能由于腺苷酸-活化蛋白激酶和內皮一氧化氮合酶的激活導致[7]。

此外，非諾貝特組視網膜組織VEGF和PKC蛋白表達水平仍高于正常組，可見非諾貝特不能完全逆轉DR的發生發展，還有多種機制及因素參與DR的進展，僅靠降低視網膜組織VEGF和PKC蛋白表達來延緩DR的發展還遠遠不夠，需要從多方面著手來延緩其發生發展，故應該繼續研究及探討。從本實驗結論及既往大規模臨床觀察研究結果[12]考慮，糖尿病患者若無禁忌情況下應盡早應用非諾貝特，至少在發生增殖性視網膜病變之前即開始應用，從而更好地延緩DR的發生發展，應用非諾貝特與應用降糖及降壓藥物同等重要。

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Effects of fenofibrate on early retinopathy in rats with experimental diabetes

GUAN Qinghua, KUANG Jinsong, ZHAO Yurong, CHENG Lan, ZHANG Xiubin

(Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of fenofibrate on vascular endothelial growth factor (VEGF) and protein kinase C (PKC) expression and cell apoptosis in retinal tissue of rats with earlier diabetic retinopathy (DR), and explore the mechanism of fenofibrate for the prevention and treatment of early DR. Methods 50 male healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (10 cases), fenofibrate group (20 cases) and diabetes mellitus (DM) group (20 cases). The animals in fenofibrate group and DM group were injected streptozotocin (STZ) intraperitoneally once to set up DM model. Then the animals were fed with fenofibrate (10 mg/kg) and feed mixture in fenofibrate group and normal feed in DM group and normal control group. The blood-fasting glucose at the end of the 4th week, 8th week, 12th week and 16th week were detected. After 16 weeks the rats were sacrificed and retinal tissue was obtained for immunohistochemical staining to detect the expression of VEGF and PKC, the apoptosis in retina was detected by TdT-dUTP terminal nick-end labeling (TUNEL) staining. Results The blood-fasting glucose levels of the fenofibrate group and DM group were significantly higher than that of the normal control group at the end of the 4th week, 8th week, 12th week and 16th week (all P<0.05), but there were no significant difference between the fenofibrate group and DM group (P>0.05). There were significant differences in the expressions of VEGF and PKC at the end of the 16th week among the three groups (all P<0.05), and which were significantly higher in the fenofibrate group and DM group than those in the normal control group (all P<0.05), but that of the fenofibrate group was lower than that of the DM group (P<0.05). The apoptosis index of fenofibrate group and DM group were higher than that of the normal control group (all P<0.05), but which of the fenofibrate group was significantly lower than that of the DM group (P<0.05). Conclusion Fenofibrate can down regulate the expression of VEGF and PKC in retinal tissue of earlier DM rats and reduce the apoptosis of retinal tissue, which may interfere in the development of earlier DR.

Key words:diabetic retinopathy; fenofibrate; vascular endothelial growth factor; protein kinase C; cell apoptosis

[收稿日期]2015-09-05

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)06-0578-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.003

[基金項目]沈陽市科技局課題(F11-262-9-25)

[作者簡介]關清華，女，碩士，主治醫師，主要從事糖尿病及其并發癥的研究。[通信作者]曠勁松， E-mail：kjs_1965@163.com