傳染性法氏囊病致病機(jī)理研究

尹偉+孫啟才

【摘 要】傳染性法氏囊病（IBDV）是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。本文對(duì)傳染性法氏囊病作了簡介，從IBDVD 病理組織學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、抗原變異、毒力以及病毒復(fù)制入手，探討IBDV的致病機(jī)理。從IBDV 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，炎癥反應(yīng)，免疫抑制等方面探討其分子致病機(jī)理。隨著對(duì)傳染性法氏囊病毒致病機(jī)制研究的不斷深入，以期為設(shè)計(jì)抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)，為該病的預(yù)防提供理論依據(jù)和線索。

【關(guān)鍵詞】傳染性法氏囊病；細(xì)胞凋亡；致病機(jī)理

0 前言

傳染性法氏囊病（IBDV）是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。該病被發(fā)現(xiàn)已有半個(gè)世紀(jì)，至今仍一直遍布世界各養(yǎng)禽區(qū)域，在工業(yè)化養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達(dá)國家尤甚。近年來，超強(qiáng)毒株和變異毒株的出現(xiàn)使得該病的發(fā)生和流行出現(xiàn)了新的特點(diǎn)，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的造成了巨大危害。深入了解該病的致病機(jī)制，提供有效地預(yù)防和控制該病的策略，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。IBDV的分子致病性研究經(jīng)歷了幾個(gè)階段：早期主要通過病理組織學(xué)變化、細(xì)胞免疫學(xué)分析進(jìn)行研究，隨后伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究主要集中在與抗原變異、毒力以及病毒復(fù)制上，而目前主要通過高通量的方法篩選與病毒蛋白互作的宿主蛋白，然后進(jìn)一步對(duì)篩選的相互作用蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，該方法的應(yīng)用使得越來越多的致病性相關(guān)的因子被揭示，為進(jìn)一步來闡釋病毒的分子致病機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

1 傳染性法氏囊病簡介

傳染性法氏囊病（infectious bursal disease， IBD）是禽類的一種病毒性免疫抑制性疾病，病毒主要通過侵害3-6周齡雛雞的法氏囊中樞免疫器官，破壞表面帶有sIgM的B淋巴細(xì)胞，并引起脾臟、胸腺及外周血液淋巴細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致以淋巴細(xì)胞衰竭、壞死為主要特征的一種免疫缺陷性和免疫抑制性疾病，其所致的急性炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡結(jié)果使B淋巴細(xì)胞急劇減少，導(dǎo)致免疫抑制，使感染雞對(duì)其他病原的易感性增強(qiáng) ，根據(jù)病毒中和特性不同可將IBDV分成對(duì)雞和火雞均致病血清Ⅰ型和只對(duì)火雞致病的血清Ⅱ型。根據(jù)抗原性變異和毒力的不同，血清Ⅰ型毒株又分為經(jīng)典毒株（classical virulent IBDV， cIBDV）、疫苗株（attenuated IBDV）、抗原變異毒株（antigenic variant IBDV）和超強(qiáng)毒株（very virulent IBDV， vvIBDV）[1]。

傳染性法氏囊病是一種高度接觸性傳染病，自然條件下，該病的傳播主要以口腔傳播為主，也可經(jīng)蛋垂直傳遞，各種用具、人員及昆蟲也可以攜帶病毒，進(jìn)行擴(kuò)散傳播。病毒進(jìn)入體內(nèi)主要通過巨噬細(xì)胞的吞噬作用擴(kuò)散到其他組織和器官。經(jīng)典毒株可引起感染雞群法氏囊炎癥和嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞壞死，法氏囊水腫，導(dǎo)致免疫抑制和一定水平的死亡率。一般來說，感染后第3天是死亡高峰期，但感染后5-7天仍有死亡發(fā)生，使得整個(gè)雞群死亡率可高達(dá)20%-30%。疫苗株是經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞或其他細(xì)胞系適應(yīng)的毒株，對(duì)雞不致病，因此一些毒株可作為活苗免疫雞群。超強(qiáng)毒株，該病原能引起典型的IBDV損傷，法氏囊嚴(yán)重出血，外觀呈“紫葡萄狀”，現(xiàn)已大面積流行于歐洲、東南亞、非洲等。其致死率高達(dá)60%-100%。抗原變異毒株的特點(diǎn)在于能夠突破經(jīng)典疫苗毒株的免疫保護(hù)，與抗經(jīng)典毒株血清交叉中和，感染變異毒株的雞群法氏囊嚴(yán)重萎縮卻不表現(xiàn)炎性癥狀。

IBDV屬雙RNA病毒科（Birnaviridae）禽雙RNA病毒屬（Avibirnavirus）。病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，無囊膜，T=13晶格分布，直徑約60 nm。病毒基因組為雙股雙節(jié)段RNA（double-stranded RNA， dsRNA），有A和B兩個(gè)片段組成。病毒基因組A片段全長由約3.3 kb核苷酸組成[2]，包含兩個(gè)部分重疊的開放閱讀框（open reading frames， ORFs）。

2 IBDV的致病機(jī)理

2.1 IBDVD 病理組織學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)研究

病毒感染宿主后主要臨床表現(xiàn)包括精神高度萎靡、縮頭、閉眼、呆立，羽毛蓬松，采食量明顯減少，飲水急劇增加，白色水樣稀糞，自啄肛門。該病往往突然發(fā)生，通常在感染第3天開始死亡，4-6天達(dá)到高峰，以后很快停息，表現(xiàn)為高峰死亡和迅速康復(fù)的曲線。當(dāng)前傳染性法氏囊病呈現(xiàn)出新的特點(diǎn)，近年來國內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道分離出IBDV變異毒株，其致病特點(diǎn)以出現(xiàn)亞臨床傳染性法氏囊病癥狀為主，沒有經(jīng)典毒株所致的高死亡率及典型的腿肌出血等癥狀，不引起明顯的炎癥反應(yīng)，感染雞群死亡率不高，但可引起肝臟壞死和明顯的脾臟腫大，最典型的病變是病雞法氏囊迅速萎縮，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制。而且發(fā)病日齡呈現(xiàn)兩極化趨勢，發(fā)病越早，免疫抑制越嚴(yán)重，傳染性法氏囊病繼發(fā)癥增多。免疫學(xué)研究認(rèn)為法氏囊是IB DV的靶器官，其中B 細(xì)胞對(duì)IBDV 敏感， 帶sIg M 的B 細(xì)胞為IBDV的主要靶細(xì)胞，而胸腺T 細(xì)胞對(duì)IBDV不易感，有報(bào)道指出， 感染IBDV 雛雞胸腺細(xì)胞出現(xiàn)壞死變化[3]，1日齡雛雞感染IBDV 后外周血液白細(xì)胞數(shù)量減少。

2.2 抗原變異、毒力以及病毒復(fù)制

2.2.1 抗原變異與毒力

VP2高變區(qū)內(nèi)的兩個(gè)大親水區(qū)、三個(gè)小親水區(qū)是構(gòu)成IBDV抗原變異的分子基礎(chǔ)。第1個(gè)親水區(qū)的氨基酸不直接結(jié)合mAbs，主要起穩(wěn)定抗原表位構(gòu)象的作用，變異株E的213和222位氨基酸的突變引起VP2蛋白的中和性表位的構(gòu)象改變；第2個(gè)親水區(qū)的2個(gè)氨基酸突變可能對(duì)變異株逃逸病毒中和抗體的能力是一個(gè)關(guān)鍵，且對(duì)結(jié)合mAbs的特異性也至關(guān)重要。這2個(gè)親水區(qū)是病毒中和表位的組成部分，特別是第2個(gè)親水區(qū)的氨基酸改變導(dǎo)致變異株E對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株疫苗介導(dǎo)的抗體中和作用有抵抗力各標(biāo)準(zhǔn)株的親水區(qū)序列完全保守，而在變異株中卻有數(shù)量不等的氨基酸被替代。第一個(gè)大親水區(qū)（212-224aa）殘基置換不影響抗體結(jié)合，但對(duì)抗原的構(gòu)象穩(wěn)定性有較大的影響[4]，而第二個(gè)大親水區(qū)（314-324aa）是單抗結(jié)合必需的，該區(qū)的氨基酸替代可致變異株逃逸抗體的中和作用。

2.2.2 IBDV的復(fù)制

IBDV的復(fù)制和增殖是研究其生物學(xué)特性的基礎(chǔ)，IBDV能夠在多種類型的細(xì)胞中復(fù)制，如雞源細(xì)胞： 雞胚法氏囊細(xì)胞（ CEB ）、雞胚腎細(xì)胞（CEK ）、雞胚成纖維細(xì)胞（CEF） ；非雞源細(xì)胞包括火雞胚成纖維細(xì)胞 （ TEF）， 鶴鶉胚（ QEF ）成纖維細(xì)胞，鴨胚成纖維細(xì)胞（ DEF ）， 兔腎細(xì)胞 （ PK-13 ）， 幼綠猴腎細(xì)胞（ BGM-70 ），猴腎細(xì)胞（ Vero）。IBDV在細(xì)胞中的增殖周期因細(xì)胞而異。Burkhardt等發(fā)現(xiàn)血清I 型IBDV在CEF中潛伏期為4-6 h 。目前研究中積累了大量的不同IBDV毒株在各種細(xì)胞中增殖特點(diǎn)的資料，闡明了組成病毒各蛋白組分的特點(diǎn)和功能，測定了一些病毒的全部核苷酸序列，提出了病毒致病力和抗原性差異的一些分子基礎(chǔ)，但對(duì)病毒增殖過程、病毒與敏感細(xì)胞間相互作用的機(jī)制仍知之較少。其原因主要有： 即使在產(chǎn)生高滴度病毒時(shí)，也僅僅是有限的培養(yǎng)細(xì)胞被感染而支持病毒的復(fù)制。目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBDV 可能通過受體介導(dǎo)接入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)受體有細(xì)胞膜上的a4β1整合素（integrin）、雞熱應(yīng)激蛋白-90（HSP90）以及B 細(xì)胞表面IgM（sIgM）。

3 IBDV分子致病機(jī)理

3.1 IBDV 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

IBDV感染引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死是法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞衰竭的兩個(gè)重要原因。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體清除多余、變異或惡化細(xì)胞的一種主動(dòng)的、程序化的生理過程。體外試驗(yàn)表明， IBDV可以引起多種動(dòng)物細(xì)胞系發(fā)生凋亡。且各細(xì)胞系發(fā)生凋亡的時(shí)間各不一樣，CEF 細(xì)胞在感染早期（ 病毒吸附CEF后）就可誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，而Vero細(xì)胞則在感染夠6小時(shí)才開始凋亡。大量研究表明，細(xì)胞凋亡過程中需要新的基因表達(dá)，而且細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及原癌基因、細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞骨架、受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、細(xì)胞因子和免疫蛋白等都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。葉研究比較了IBDV感染前、后兩個(gè)Vero文庫間基因表達(dá)的差異，將顯著差異基因的KEGG和Bioarta數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行搜索與分析，初步分析顯現(xiàn)，在IBDV感染過程中細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制之一是：Gadd45a結(jié)合EF-1α蛋白，抑制其穩(wěn)定微管聚合的作用，Bim蛋白得以由細(xì)胞骨架解離并轉(zhuǎn)位于線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，激發(fā)線粒體凋亡途徑。這提示細(xì)胞受到損傷后細(xì)胞骨架穩(wěn)定性的改變在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中起重要作用。生物內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定不但依賴于細(xì)胞的增殖分化，也依賴于細(xì)胞的凋亡。目前認(rèn)為dsRNA主要通過活化PKR和OAS/RnaseL通路抑制蛋白合成或dsRNA敏感機(jī)制激活Caspase-8途徑誘導(dǎo)凋亡[5]。然而，病毒復(fù)制依賴于宿主細(xì)胞器的合成功能，如果細(xì)胞凋亡過快，病毒則不能完成復(fù)制，故有些病毒本身又帶有抑制細(xì)胞凋亡因子，延緩細(xì)胞死亡有利于病毒的復(fù)制。

3.2 IBDV 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

宿主T 細(xì)胞可抗拒IBDV病毒感染并促進(jìn)病毒清除，但是其調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。Abdul Rauf等人通過CD4+ 和 CD8+ T細(xì)胞滲入法氏囊對(duì)病毒分子致病機(jī)制和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的病毒清除機(jī)制進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明：一些重要的細(xì)胞因子如穿孔素（PFN）、粒酶A（Gzm-A）、DNA修復(fù)凋亡蛋白、高速流動(dòng)性蛋白（HMG）、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）、Th1、 IL2 和 IFN-r顯著上調(diào)，而表達(dá)的自然殺傷細(xì)胞裂解素則顯著下調(diào)。顯著表達(dá)上調(diào)的Th1、 IL2 和 IFN-r，證明了T細(xì)胞的激活。巨噬細(xì)胞在先天性和獲得性免疫中扮演著重要角色，病毒感染后可調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)增強(qiáng)或減弱巨噬細(xì)胞功能從而引起免疫發(fā)病或者免疫逃逸。M. Khatri等人建立了一個(gè)IBDV病毒和巨噬細(xì)胞在急性感染階段的互作模型，并證明了IBDV感染后可激活巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和化學(xué)物質(zhì)來促進(jìn)局部炎癥和組織損傷細(xì)胞因子可廣泛調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答，但有關(guān)IBDV感染引起細(xì)胞因子變化的鮮有報(bào)道，最近，劉等人研究發(fā)現(xiàn)不同毒力的IBDV可誘導(dǎo)雞體內(nèi)細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，細(xì)胞因子在超強(qiáng)毒株感染的急性階段扮演著重要角色，且不同毒力的IBDV株通過不同的信號(hào)通路引起免疫反應(yīng)。

3.3 IBDV的免疫抑制

1972年， Faragher等人首次報(bào)道了IBDV感染后引起雛雞的免疫抑制現(xiàn)象，他們通過研究不同日齡的雛雞在感染IBDV后，新城疫抗體產(chǎn)生的情況，發(fā)現(xiàn)1日齡的雛雞感染IBDV后，對(duì)新城疫疫苗免疫后抗體的產(chǎn)生有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用會(huì)隨感染病毒雛雞日齡的增大而顯著下降，當(dāng)14或21日齡雛雞感染后，這種抑制作用已不再明顯。隨后的研究證實(shí)[6]，IB D V 感染不僅引起雛雞全身體液免疫和細(xì)胞免疫功能顯著抑制， 而且導(dǎo)致消化道和呼吸道局部的體液免疫和細(xì)胞免疫水平也明顯降低。此外，研究者也證實(shí)IBDV的免疫抑制效應(yīng)因毒株不同而表現(xiàn)不同。最新有關(guān)傳染性法氏囊病引起免疫抑制的機(jī)理研究，王永強(qiáng)等人發(fā)現(xiàn)VP4 能抑制宿主細(xì)胞I 型干擾素的表達(dá)，并通過酵母雙雜和CO-IP及激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)了VP4作用于宿主細(xì)胞靶蛋白GLIZ（糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白）。RNAi技術(shù)也證實(shí)了VP4通過GLIZ 抑制I型干擾素的表達(dá)以及子代病毒的復(fù)制。該結(jié)果初步揭示了IBDV 引起免疫抑制的分子機(jī)理。

4 小結(jié)

法氏囊是IBDV感染的靶器官，其所致的急性炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡結(jié)果使B淋巴細(xì)胞急劇減少，導(dǎo)致免疫抑制，使感染雞對(duì)其他病原易感性增強(qiáng)。IBDV還能感染巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子和化學(xué)因子，在IBDV感染宿主的過程中發(fā)揮作用。隨著對(duì)傳染性法氏囊病毒致病機(jī)制研究的不斷深入，為設(shè)計(jì)抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)，為該病的預(yù)防和控制制提供了理論依據(jù)和線索。

【參考文獻(xiàn)】

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[責(zé)任編輯：王偉平]