E3泛素連接酶對卵巢癌細胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響

王小特++曹怡

[摘要] 目的 探討E3泛素連接酶（EDD）基因在SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥中的作用。 方法 采用RT-PCR和Western blot檢測人卵巢癌SKOV3細胞和SKOV3/DDP細胞內EDD表達水平的差異。通過轉染EDD-siRNA沉默EDD的表達后，噻唑藍法檢測順鉑對SKOV3/DDP細胞增殖的影響，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測順鉑對細胞凋亡的影響；Western blotting檢測髓樣細胞白血病-1（Mcl-1）和細胞周期檢測點激酶2（CHK2）蛋白表達水平。 結果 SKOV3細胞EDD的表達水平顯著低于卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP（P < 0.05）。EDD-siRNA轉染24 h后，EDD mRNA和蛋白表達水平均顯著低于未轉染組（P < 0.05）；SKOV3/DDP細胞IC50值顯著降低（P < 0.05），Mcl-1蛋白的表達受到抑制（P < 0.05），而CHK2無明顯變化（P > 0.05）。 結論 EDD-siRNA能沉默EDD基因，降低Mcl-1蛋白的表達水平，增強順鉑對SKOV3/DDP細胞的促凋亡作用，降低SKOV3/DDP細胞對順鉑的耐藥性，有效恢復SKOV3/DDP細胞順鉑敏感性。

[關鍵詞] EDD；卵巢癌；順鉑耐藥；細胞凋亡

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（b）-0020-05

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其最主要的治療策略是腫瘤細胞減滅術聯合鉑類藥物為基礎的化療法，然而鉑類耐藥的形成是目前腫瘤治療過程中的主要障礙之一，因此，研究卵巢癌細胞的耐藥機制對卵巢癌提供新的治療方法具有十分重要的作用。E3泛素連接酶（E3 isolated by differential display，EDD）包括一個羥基末端的連接酶（HECT）泛素連接酶域，是果蠅腫瘤抑制因子hyd的人同源因子[1]，位于染色體8q22.3上，這個染色體區域通常與順鉑耐藥具有一定的聯系[2]。EDD在卵巢癌、乳腺癌和胃癌中均存在過表達的現象[3-6]，高表達的EDD蛋白可作用于鈣整合素結合蛋白1和細胞周期檢測點激酶2（checkpoint kinase 2，CHK2），上調DNA損傷通路相關基因的表達，增強DNA損傷修復能力，增加順鉑等化療藥物的耐藥性[7-9]，DNA損傷通路的大部分基因與鉑類等化療藥物敏感性降低之間有一定的聯系[10]。本研究旨在通過轉染EDD-siRNA沉默EDD在耐藥細胞SKOV3/DDP的表達，探討EDD的表達在卵巢癌順鉑耐藥形成過程中的作用，并初步探索其相關機制，以期為恢復卵巢癌的順鉑敏感性提供理論基礎，為卵巢癌的治療提供有力的線索。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

SKOV3、SKOV3/DDP（北京腫瘤醫院藥物研究所）；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640（美國Gibco）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和胰蛋白酶（美國Sigma）；順鉑（齊魯制藥有限公司）；RNA提取試劑盒（美國Invitrogen）；逆轉錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；SsoFastTM EvaGreen Supermix （BIO-RAD）；RIPA細胞裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；EDD抗體、2CHK2抗體、髓樣細胞白血病-1（Mcl-1）抗體和兔抗β-actin抗體（上海艾碧康生物制品有限公司）；Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑（美國Invitrogen）；EDD-siRNA（5'-CCAUUUACCCUGGCUAGUA-3'，美國Sigma-Aldrich）；非特異性siRNA序列（5'-CUGGAGUUGUCCCAAUUCU-3'，Ambion）；細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。

1.2 細胞培養

將SKOV3和SKOV3/DDP細胞各5×104個培養在含10% FBS的RPMI 1640培養基中，在37℃ 5%CO2的飽和濕度條件下培養。每3天傳代1次，取對數生長期細胞進行相關實驗。

1.3 RNA干擾

siRNA轉染SKOV3/DDP細胞步驟按照Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑說明書進行。轉染后培養24 h，實驗分為4組細胞：SKOV3細胞，SKOV3/DDP細胞，SKOV3/DDP細胞+非特異性siRNA（NC siRNA）和SKOV3/DDP細胞+EDD-siRNA。

1.4 RT-PCR檢測EDD mRNA的表達

按試劑盒說明提取細胞中RNA并進行逆轉錄和PCR擴增。EDD mRNA上游引物：5'-TTAGGCTTTTGGTAAATGGCTGCG-3'，下游引物：5'-TGAGGGCATAGGCTGGAATCCTTC-3'。內參GAPDH上游引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR擴增反應體系（10 μL）為：上下游引物各2 μL，5 μL SsoFastTM EvaGreen Supermix，1 μL cDNA；反應條件：94℃ 4 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 20 s，共35個循環，72℃ 10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖電泳鑒定。試驗重復3次，每次5個復孔。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達

提取細胞蛋白并測量蛋白濃度，Western blot檢測EDD、CHK2以及Mcl-1蛋白表達。以β-actin為內參，每組上樣量50 μg，一抗（1∶400稀釋）溫室孵育2 h，二抗（1∶2000稀釋）孵育1.5 h，DAB顯色，暗室曝光。試驗重復3次，每次5個復孔。

1.6 MTT檢測SKOV3/DDP細胞順鉑半數抑制濃度（IC50）的變化

取對數生長期細胞進行培養，分別加入終濃度為0（對照組）、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 μg/mL的順鉑培養基培養48 h，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT后培養4 h，棄上清液并在每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min使其充分溶解后，酶標儀上測定OD490值。抑制率=（對照組OD值-用藥組OD值）/對照組OD值×100%，Logistic回歸法計算IC50。相對逆轉效率=[IC50（SKOV3/DDP）-IC50（SKOV3+EDD-siRNA）]/[IC50（SKOV3/DDP）-IC50（SKOV3）]×100%。試驗重復3次，每次5個復孔。

1.7細胞凋亡檢測

20 μg/mL的順鉑處理各組細胞24 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞凋亡的檢測參照細胞凋亡試劑盒說明書進行。收集5×105個細胞，加入500 μL結合緩沖液懸浮細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光反應15 min，上機進行檢測。試驗重復3次，每次5個復孔。

1.8 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EDD在SKOV3和SKOV3/DDP細胞中的表達

EDD基因和蛋白表達水平如圖1所示，SKOV3細胞中EDD基因與蛋白表達水平均顯著低于耐藥細胞SKOV3/DDP（P < 0.05）；EDD-siRNA處理24 h后，EDD mRNA表達水平顯著降低（P < 0.05）。Western blot結果顯示EDD-siRNA顯著抑制了SKOV3/DDP細胞中EDD蛋白的表達（P < 0.05），而NC siRNA對EDD mRNA和蛋白表達水平均無影響（P > 0.05）。見表1。

A：EDD mRNA表達；B：EDD表達電泳圖；C：EDD蛋白表達；1：SKOV3細胞；2：SKOV3/DDP細胞；3：SKOV3/DDP細胞+NC siRNA；4：SKOV3/DDP細胞+EDD-siRNA；與SKOV3細胞比較，*P < 0.05；與SKOV3/DDP細胞+EDD-siRNA比較，#P < 0.05

2.2 EDD-siRNA對SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥指數的影響

MTT檢測細胞順鉑耐藥結果顯示，EDD-siRNA顯著降低了SKOV3/DDP細胞的IC50值[（4.93±0.75）比（13.18±1.46），P < 0.05]，對順鉑耐藥的逆轉效率高達77.03%，表明EDD-siRNA降低了SKOV3/DDP細胞對順鉑的耐藥性（P < 0.05）。見表2。

2.3 EDD-siRNA對順鉑誘導SKOV3/DDP細胞凋亡的影響

為了研究順鉑對細胞凋亡的影響，本試驗用20 μg/mL的順鉑作用細胞后，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測了細胞的凋亡率。結果顯示（圖2），轉染EDD-siRNA使細胞凋亡率從（5.00±1.10）%上升到（40.12±3.78）%，顯著增強了順鉑對SKOV3/DDP細胞的凋亡誘導作用（P < 0.05）。

2.4 沉默EDD對SKOV3/DDP細胞CHK2和Mcl-1蛋白表達的影響

為檢測沉默SKOV3/DDP細胞中EDD的表達對CHK2和Mcl-1蛋白的影響，在成功轉染EDD-siRNA后，用Western blotting檢測了各組細胞中CHK2和Mcl-1蛋白表達水平（圖3）。結果顯示，EDD-siRNA使EDD沉默后，Mcl-1蛋白的表達被顯著抑制（P < 0.05），而CHK2蛋白未檢測到明顯差異（P > 0.05）。見表3。

3 討論

隨著對腫瘤研究的深入，腫瘤治療過程中細胞的化療耐藥越來越被重視。研究表明，EDD mRNA在化療后卡鉑耐藥性卵巢癌細胞[11-12]和順鉑耐藥黑素瘤細胞中[13]表達水平均升高，提示EDD在腫瘤細胞順鉑耐藥性中具有一定的作用。本試驗檢測了順鉑耐藥細胞SKOV3/DPP和非耐藥細胞SKOV3細胞中EDD的表達水平，結果發現，無論是在mRNA水平還是蛋白水平，SKOV3/DDP細胞中EDD表達水平均顯著高于SKOV3細胞，表明EDD可能是卵巢癌細胞順鉑耐藥形成的相關因子。

為進一步明確EDD與卵巢癌細胞順鉑耐藥性的相關性，本研究用EDD-siRNA轉染SKOV3/DDP細胞沉默EDD表達后，對細胞的順鉑耐藥指數進行了檢測，結果發現使EDD基因表達沉默后，SKOV3/DDP細胞對順鉑的耐藥性性顯著降低，對順鉑耐藥的逆轉效率高達77%。O'Brien等[7]研究發現，沉默對順鉑高度耐藥的卵巢癌細胞A2780-CP70中EDD的表達后，其對順鉑的敏感性增加。Bradley等[14]的研究也發現A2780ip2和OVCAR5 EDD shRNA細胞的順鉑敏感性顯著高于對照組。以上結果表明EDD在卵巢癌細胞順鉑耐藥的形成過程中擔任著重要的角色，進一步了解EDD影響卵巢癌細胞的順鉑耐藥機制，對于卵巢癌的臨床治療將具有十分重要的意義。

順鉑作為抗腫瘤藥物的主要原因之一是其具有誘導腫瘤細胞凋亡的效力，用合適的手段刺激耐藥細胞凋亡，或調控促凋亡相關基因的表達，是恢復腫瘤細胞敏感性的一個重要方法。本試驗中，流式細胞儀的檢測結果顯示，通過轉染EDD-siRNA沉默EDD表達后，其細胞凋亡率顯著升高，表明轉染EDD-siRNA恢復了順鉑對SKOV3/DDP細胞的抗腫瘤作用。抗凋亡因子Mcl-1是順鉑作用的重要靶基因[15]，其過高表達會使癌細胞對化療產生抗性，甚至可能促進癌癥的復發[16]。本研究結果發現，沉默EDD導致Mcl-1蛋白表達也同步下調，表明抗凋亡因子Mcl-1與EDD對于調節SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥可能具有一定的協同作用。

腫瘤化療過程中產生順鉑耐藥的機制之一就是DNA損傷細胞周期檢查點通路的激活[17]。CHK2在DNA復制-監測S/G2檢查點系統中具有十分重要的作用[18]，越來越多的研究發現CHK2與腫瘤細胞的順鉑耐藥具有一定的相關性[19-20]。EDD與細胞檢查點激酶CHK2之間可相互影響[8]。為找出通過沉默EDD基因表達提高腫瘤細胞順鉑敏感性，是否對EDD和CHK2的結合有直接的影響，本試驗通過Western blotting檢測了EDD-siRNA處理后的卵巢癌耐藥細胞中CHK2蛋白水平，結果發現，siRNA使EDD沉默后，CHK2蛋白的表達并無明顯差異，其相關機制有待進一步的研究。

綜上所述，EDD-siRNA轉染可成功地抑制SKOV3/DDP耐藥細胞EDD和Mcl-1蛋白的表達，增加順鉑對SKOV3/DDP細胞的凋亡刺激作用，恢復卵巢癌耐藥細胞的順鉑敏感性。因此，本試驗結果為EDD作為卵巢癌增敏治療的靶基因提供了理論證據。

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（收稿日期：2015-05-14 本文編輯：任 念）