動脈粥樣硬化靶向適配子的親和力篩選

鐘文飛等

[摘要] 目的 篩選動脈粥樣硬化高親和力適配子，為動脈粥樣硬化靶向引導(dǎo)物的體內(nèi)應(yīng)用提供實(shí)驗基礎(chǔ)。 方法 將前期研究獲得的一組巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞適配子中的12個適配子進(jìn)行生物素標(biāo)記，采用酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗（ELONA）方法測定其親和力（Kd），采用高脂方法建立載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）動脈粥樣硬化模型，將親合力最高的適配子Cy5進(jìn)行熒光標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察其與動脈粥樣硬化病變組織的結(jié)合能力。 結(jié)果 12個巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的適配子均具有較好的親和力，解離平衡常數(shù)（Kd值）范圍在4.33～39.58 nmol/L之間，其中9號適配子（Apt9）的親和力最高，Kd值為（4.33±0.33）nmol/L，體內(nèi)親和力檢測發(fā)現(xiàn)Apt9能特異性結(jié)合ApoE-/-動脈粥樣硬化血管斑塊病變組織。 結(jié)論 篩選的Apt9適配子能與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞和動脈粥樣硬化病變血管組織特異性結(jié)合，可以用于進(jìn)一步的體內(nèi)研究。

[關(guān)鍵詞] 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞；適配子；親和力；動脈粥樣硬化

[中圖分類號] R543.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（b）-0012-05

心腦血管疾病是危害人類健康的主要疾病，動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，尋求有效的動脈粥樣硬化靶向物，應(yīng)用于動脈粥樣硬化早期診斷與治療是當(dāng)前研究動脈粥樣硬化的熱點(diǎn)問題。巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成是動脈粥樣硬化主要的細(xì)胞學(xué)改變，在動脈粥樣硬化病變斑塊的早期即大量出現(xiàn)，它的形成是動脈粥樣硬化病變形成和發(fā)展的核心步驟，泡沫細(xì)胞可以成為動脈粥樣硬化病變診斷和治療的靶點(diǎn)[1]。

指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）[2]是現(xiàn)有常用的靶向物篩選技術(shù)，通過SELEX技術(shù)可從人工合成的大容量單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選并富集獲得靶物質(zhì)特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子，適配子可作為靶向引導(dǎo)物用于疾病的診斷與治療[3]，本研究組前期利用巨噬細(xì)胞與泡沫細(xì)胞的細(xì)胞差異，利用SELEX技術(shù)篩選出了巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的12個適配子[4-5]，本研究擬采用酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗（enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA）對這些適配子進(jìn)行Kd檢測，并將篩選出的親和力最高的適配子進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗驗證動脈粥樣硬化病變組織特異性，為動脈粥樣硬化體內(nèi)靶向引導(dǎo)物的研究提供實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.1.2 實(shí)驗動物 載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠20只，雄性，6周齡，體質(zhì)量（17±2）g，購于北京大學(xué)實(shí)驗動物部，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2006-0008。

1.1.3 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；油紅O、鮭魚精DNA（Sigma公司）；佛波酯（calbiochem公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠高脂飼料、普通飼料（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心）。

1.1.4 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 適配子的合成 生物素與Cy5熒光素標(biāo)記的適配子由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 泡沫細(xì)胞模型的建立 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板（美國Constar公司）中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗前用100 nmol/L丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）誘導(dǎo)72 h，使其分化成巨噬細(xì)胞，再用80 mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育72 h，誘導(dǎo)分化成泡沫細(xì)胞。

1.2.3 動脈粥樣硬化動物模型的建立 ApoE-/-小鼠，普通飼料飼養(yǎng)2周適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分成2組，每組10只。正常組給予普通飼料飼養(yǎng)，動脈粥樣硬化模型組在普通飼料的基礎(chǔ)上添加1.5%膽固醇和15%豬油高脂飼養(yǎng)。12周后麻醉處死動物，將主動脈段（自升主動脈至髂總動脈分叉）取出，中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，用Leitz1560切片機(jī)連續(xù)切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，經(jīng)病理鑒定，動脈粥樣硬化造模成功。

1.2.4 適配子親和篩選 1×106 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，THP-1細(xì)胞用100 nmol/L的PMA誘導(dǎo)72 h，使其分化成巨噬細(xì)胞，再用80 mg/L ox-LDL共孵育72 h，誘導(dǎo)成泡沫細(xì)胞，4%的多聚甲醛固定30 min。用1×磷酸鹽緩沖液（PBS）洗板5次，5%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封閉2 h，1×PBST（0.01% Tween-20）洗板5次。用PBS（含0.01%鮭魚精DNA）將生物素標(biāo)記的適配子與文庫進(jìn)行稀釋，樣品終濃度分別為1000、400、160、64、25、10、4 nmol/L，每組3個復(fù)孔。樣品在95℃處理5 min后立刻置于冰上10 min，加入泡沫細(xì)胞的培養(yǎng)孔中37℃孵育1 h，1×PBST洗板5次，拍板。每孔加入50 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素-PBS溶液（稀釋比1∶3000），37℃孵育30 min后洗滌5次，拍板。每孔加入50 μL TMB顯色液，37℃避光顯色10 min后每孔加50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光度。

1.2.5 9號適配子與動脈粥樣硬化病變小鼠的體內(nèi)熒光成像 模型組與正常組分別經(jīng)尾部靜脈注射0.5 mL（10 μg DNA/10 mg體重）9號適配子（Apt9），30 min后，避光取出主動脈進(jìn)行常規(guī)冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝像。