不同生物狀態白色念珠菌對口腔上皮細胞的黏附能力及ALS mRNA表達

張輝等

[摘要] 目的 觀察不同生物狀態白色念珠菌對口腔上皮細胞的黏附能力及ALS mRNA表達，以期揭示口腔白色念球菌感染機制。 方法 將白色念珠菌3683、SC5314、3630與來源于50名健康志愿者的口腔上皮細胞混合培養，采用革蘭陽性染色觀察白色念珠菌的黏附能力，采用熒光定量RT-PCR法檢測白色念珠菌3683、SC5314、3630中ALS2及ALS3 mRNA表達情況。采用SPSS 15.0統計學軟件進行數據分析。 結果 黏附實驗結果顯示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細胞，且菌株3683黏附數量明顯多于菌株SC5314和菌株3630，統計學比較顯示，差異有統計學意義（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附數量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。熒光定量RT-PCR結果顯示，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測到ALS2及ALS3 mRNA表達，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達水平均高于菌株SC5314和菌株3630，統計學比較顯示，差異有統計學意義（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達水平均高于菌株SC5314，但兩者比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 不同生物狀態白色念珠菌的口腔上皮細胞黏附能力不同，菌株黏附能力的強弱可能與其ALS2及ALS3基因情況表達相關。

[關鍵詞] 白色念珠菌；口腔上皮細胞；黏附能力；基因表達

[中圖分類號] R781 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（b）-0016-04

白色念珠菌為條件致病菌，長居于人體口腔、皮膚、胃腸道等部位，在維持機體生態平衡方面發揮重要作用。近年來由于免疫抑制劑、抗生素等的廣泛使用，及糖尿病、艾滋病等發病率的逐年增加，導致患者機體免疫力低下，菌群失衡，使得白色念球菌大量繁殖，口腔白色念球菌感染率增加。白色念球菌的致病力與其黏附性有關[1-2]。研究顯示，在小鼠感染模型中，口腔感染念球菌分離株3683、皮膚感染念球菌分離株3630及系統感染血液念球菌分離株SC5314致病能力差異較大，各菌株的黏膜黏附力不同可能是影響其致病能力的原因之一[3]。ALS基因家族主要編碼白色念珠菌細胞壁表面的糖蛋白，與白色念珠菌和宿主間的黏附性密切相關。有研究證實，白色念球菌ALS基因在生物膜中的表達升高[4-5]。本研究刮取人口腔上皮細胞，并與白色念珠菌3683、SC5314、3630混合培養，檢測不同生物狀態白色念珠菌對口腔上皮細胞黏附能力及ALS mRNA表達情況，以期觀察不同白色念珠菌致病力的差異，探討其感染作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

白色念珠菌3683、SC5314、3630購自于ATCC；人口腔上皮細胞來源于50名健康志愿者。

1.2 試劑與儀器

沙堡液體培養基、RPMI 1640培養基及胎牛血清均購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；EDTA及細胞計數板購自上海碧云天生物技術有限公司；Trizol購自美國Invitrogenin公司；熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；引物購自上海生工；搖床購自德國UniEquip公司；ABI 3900臺式高通量DNA合成儀、ABI 9700 PCR儀及ABI 7500全自動熒光定量均購自美國ABI公司。

1.3 白色念珠菌培養

將白色念珠菌3683、SC5314、3630接種于20 mL沙堡液體培養基中，于搖床培養18 h（37℃，200 r/min）。收集細菌，PBS洗2次，調整菌密度為1×107個/mL。

1.4 人口腔上皮細胞獲取及培養

以細胞刮棒刮取來自浙江省溫嶺市第一人民醫院的50名健康志愿者口腔上皮細胞，PBS洗兩次，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中，調整細胞密度為1×107個/mL。

1.5 黏附能力檢測

將口腔上皮細胞與白色念珠菌3683、SC5314、3630以1∶100比例混合置于6孔板內，在搖床中孵育1 h（37℃，100 r/min）。行革蘭陽性染色，顯微鏡下隨機選擇50個口腔上皮細胞，計數每個口腔上皮細胞上黏附的白色念珠菌數。實驗重復3次。黏附能力計算為念球菌數/口腔上皮細胞數。

1.6 熒光定量RT-PCR

1.6.1 白色念珠菌

白色念珠菌培養同“1.3”項下，PBS洗3次，調整菌密度為2×106個/mL。

1.6.2 口腔上皮細胞

細胞獲取同“1.4”項下，調整細胞密度為2×105個/孔接種于6孔板。

1.6.3 共培養及觀察

將口腔上皮細胞與白色念珠菌3683、SC5314、3630分別以1∶10比例混合，RPMI 1640培養基培養，接種于6孔板，每孔1.5 mL，培養6 h，光學顯微鏡觀察后，收集細胞，離心，置于-80℃冰箱保存。

1.6.4. 引物設計

ALS2：上游引物：5'-CCA AGT ATT AAC AAA GTT TCA ATC ACT TAT-3'，下游引物：3'-TCT CAA TCT TAA ATT GAA CGG CTT-5'，引物長度為366 bp。

ALS3：上游引物：5'-CCA CTT CAC AAT CCC CAT C-3'，下游引物：3'-CAG CAG TAG TAG TAA CAG TAG TAG TTT CAT C-5'，引物長度為342 bp。

GAPDH：上游引物：5'-TTG ACG GTC CAT CCC ACA A-3'，下游引物：3'-GGA ATA ACC TTA CCA ACG GCT TT-5'，引物長度為103 bp。

1.6.5 總RNA提取

用預冷的DEPC水1 mL清洗白色念珠菌，置于1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，蓋緊EP管，上下傾倒15 s，室溫靜置2～3 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清；加入0.5 mL異丙醇，-20℃放置1 h，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清；75%乙醇洗2次，4℃ 12000 r/min離心5 min，棄上清，吸取殘存乙醇；無菌臺干燥5～10 min，加DEPC水溶解，-80℃保存備用。

1.6.6 RNA純度檢測

應用紫外分光光度計檢測RNA純度，分別測定260 nm和280 nm波長下RNA的吸光度，計算A260/A280，若比值在1.8～2.0之間則提示RNA質量較好。

1.6.7 逆轉錄反應

反應體系為5×逆轉錄buffer 2 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、dNTP 2 μL、RNase free dH2O 7.5 μL、OligodT 1 μL、Mgcl2 4 μL、AMV反轉錄酶 1 μL、RNA模板2 μL，反轉錄體系共計20 μL；混勻后置于PCR儀中，反應條件為：42℃ 1 h，99℃ 5 min；得到cDNA模板，置于-20℃保存。

1.6.8 熒光定量PCR

1.6.8.1 標準品制備 陽性標準品：預實驗PCR擴增陽性產物經瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下切割目的條帶。采用回收試劑盒回收純化。利用A260測得值和片段長度計算其濃度，作為陽性標準品。陰性標準品：采用滅菌雙蒸水。

1.6.8.2 反應體系 5×SYBR Green Ⅰ PCR buffer 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTPs 1 μL，Taq酶1 μL，cDNA或陽性標準品1 μL，ddH2O 35 μL，反應體系共計50 μL。

1.6.8.3 反應條件 95℃ 3 min，95℃ 30 s，50℃ 45 s，共行42個循環。

1.6.8.4 數據測定 反應結束后，電腦分析結果，RNA表達=目的基因拷貝數/GAPDH基因拷貝數。

1.7 統計學方法

采用SPSS 15.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白色念珠菌對口腔上皮細胞的黏附能力

白色念珠菌3683、SC5314、3630與口腔上皮細胞共培養1 h后，革蘭染色結果顯示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細胞，且菌株3683黏附數量（15.74±0.83）明顯多于菌株SC5314（13.04±0.62）和菌株3630（13.11±0.57），差異有統計學意義（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附數量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。

2.2 ALS2及ALS3 mRNA表達情況

念珠菌口腔與上皮細胞混合培養6 h，顯微鏡下觀察顯示口腔上皮細胞形態完整，周圍黏附有白色念球菌，部分細胞已破裂為細胞碎片。基因檢測結果顯示，混合培養6 h后，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測到ALS2及ALS3 mRNA表達，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達率均高于菌株SC5314和菌株3630，統計學比較顯示，差異有統計學意義（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達水平均高于菌株SC5314，但兩者比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

3 討論

白色念球菌是人體重要的機會致病菌，調查表明，近年白色念球菌的檢出率逐年升高，其導致的醫院感染排在第4位，且死亡率高達50%左右[6-7]。研究已經證實，黏附性為白色念球菌的致病機制之一[8]。過往白色念球菌對口腔上皮細胞的黏附性研究較多，但不同生物狀態白色念珠菌黏附性的差異鮮有報道。本研究觀察白色念珠菌3683、SC5314、3630對口腔上皮細胞的黏附能力，對治療選擇的臨床指導意義重大。

本研究黏附實驗是將白色念珠菌與口腔上皮細胞混合培養，觀察一定時間后每個口腔上皮細胞黏附白色念珠菌數，該方法可直觀證明菌株的黏附力，且操作簡單[9]。本研究黏附實驗結果顯示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細胞，且菌株3683黏附數量明顯多于菌株SC5314和菌株3630，統計學比較顯示，差異有統計學意義（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附數量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。提示白色念珠菌株3683的黏附力最強，其對口腔的致病力最強。導致不同生物狀態白色念珠菌對口腔上皮細胞黏附能力差異的原因有待進一步分析。Zhao等[10]研究證實，野生型白色念球菌株（CA112）、剔除ALS3基因的白色念球菌株（als3/als31843）及剔除了ALS1基因的白色念球菌株（als1/als11467）對頰上皮細胞和血管內皮包被的細胞培養板的黏附作用不同，其中，菌株als3/als31843對頰上皮細胞和血管內皮細胞的黏附數明顯較低，而菌株als1/als11467僅對血管內皮細胞的黏附能力較低。該結果提示了ALS家族基因功能的差異性及ALS3基因可能參與了白色念珠菌的黏附作用機制。

研究發現，ALS家族各基因的功能不同[11-12]。一項對陰道念球菌感染的研究發現，雖然在感染過程中ALS家族各基因均檢出，但ALS3基因的檢出率最高[13]。小鼠口腔念球菌感染模型初期檢測顯示，ALS1～4均可檢出，提示其在念球菌感染初期已表達[14-15]。本研究結果顯示，念珠菌口腔與上皮細胞混合培養6 h，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測到ALS2及ALS3 mRNA表達，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達率均高于菌株SC5314和菌株3630，差異有統計學意義（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達率均高于菌株SC5314，但兩者比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。結合本研究黏附實驗結果可見，白色念珠菌對口腔上皮細胞的黏附能力與菌株中ALS2及ALS3基因的表達強弱有關，其中黏附能力強的菌株3683其ALS2及ALS3基因表達水平高。提示ALS2及ALS3基因高表達可能為口腔白色念球菌感染致病機制之一。