G—RH2誘導人肺腺癌A549細胞凋亡的實驗研究

張悅萌　張大力　安昌善

【摘要】 目的 探討人參皂甙RH2（G-RH2）對人肺腺癌A549細胞凋亡的影響。方法 分析G-RH2對A549細胞周期及細胞凋亡的影響， 并檢測G-RH2對A549細胞相關基因表達的影響。結果 0～60 μmol的G-RH2作用A549細胞72 h后， 實驗組G1期細胞比率隨藥物濃度的增加而增加， S期細胞比率隨藥物濃度的增加而遞減， G2期細胞無明顯變化。Bax、Bid及Cyto-C表達量隨藥物濃度增加而增加， Bcl-2、細胞外信號調節激酶（ERK）及P-ERK表達量隨藥物濃度的增加而降低。結論 G-RH2可以誘導人肺腺癌A549細胞凋亡， G-RH2抗腫瘤藥物值得臨床開發和應用。

【關鍵詞】 人參皂甙RH2；肺腺癌；A549細胞；細胞凋亡

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.11.215

G-RH2， 即四環三萜類寡低糖鏈人參二醇型皂甙單體， G-RH2可以通過誘導分化或者誘導調亡， 抑制多種腫瘤細胞的生長、增殖， 而且其具有很強的抗腫瘤活性[1]， 本實驗以人源肺腺癌細胞A549為研究對象， 主要運用流式細胞技術檢測G-RH2處理的A549細胞周期改變情況， 最后從蛋白水平用Westen blotting方法驗證特定蛋白表達水平的變化， 探討其發揮抗腫瘤效應的關鍵蛋白及分子信號傳導通路， 希望通過研究能促進G-RH2抗腫瘤藥物的進一步開發和更廣泛的臨床應用。現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 延邊大學藥學院藥物分析實驗室提供的人肺腺癌A549細胞系。

1. 2 方法 從-80℃冰箱中取出A549細胞凍存管先進行細胞復蘇、細胞培養及細胞傳代， 用G-RH2處理A549細胞， 采用流式細胞技術分析G-RH2對A549細胞周期及細胞凋亡的影響；對G-RH2處理A549細胞提取蛋白質并測定蛋白質濃度， 電泳， 并用Westren blotting化學發光顯影定影檢測G-RH2對A549細胞相關基因表達的影響。

2 結果

2. 1 G-RH2對A549細胞周期及凋亡的影響 分別以 0、10、20、40、60 μmol的G-RH2作用A549細胞72 h后， G1期細胞比率分別為（61.3±2.1）%、（65.4±1.8）%、（68.9±2.4）%、（78.8±1.7）%、（85.3±1.5）%； S期細胞比率分別為（26.3±2.1）%、（22.3±2.4）%、（16.3±1.5）%、（11.3±1.5）%、（9.3±2.3）%；G2期細胞比率分別為（12.4±1.3）%、（12.3±1.4）%、（14.8±2.0）%、（9.1±1.7）%、（6.4±1.3）%， 經比較可見G-RH2作用于A549細胞后， A549細胞的凋亡比率呈濃度依賴性遞增， G1期細胞比率隨藥物濃度的增加而增加， S期細胞比率隨藥物濃度的增加而遞減， 波峰前移， G2期細胞無明顯變化。

2. 2 G-RH2對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響 分別以0、10、20、40、60 μmol的G-RH2作用A549細胞72 h后， Western bolt法檢測Bcl-2家族系列蛋白的表達變化， 以β-actin為內參對照。Bax的表達量分別為（112.56±0.65）%、（123.77±2.17）%、（136.74±1.17）%、（147.61±0.77）%、（159.38±0.53）%；Bcl-2的表達量分別為（183.28±0.79）%、（178.31±1.35）%、（177.90±1.24）%、（166.96±0.47）%、（147.15±1.41）%；Bid的表達量分別為（97.18±0.60）%、（99.94±0.06）%、（105.02±0.99）%、（104.95±0.53）%、（126.98±0.43）%；Cyto-C的表達量分別為（108.38±0.51）%、（114.44±0.30）%、（122.68±0.46）%、（126.26±0.59）%、（133.04±0.44）%；EPK的表達量分別為（46.28±0.10）%、（58.74±0.53）%、（89.31±0.69）%、（49.53±0.50）%、（38.90±2.11）%；P-ERK的表達量分別為（160.26±0.59）%、（169.32±0.37）%、（173.62±0.44）%、（174.03±0.64）%、（181.71±0.51）%；經比較可見G-RH2作用A549細胞后， Bax、Bid及Cyto-C表達量隨藥物濃度增加而增加， Bcl-2、ERK及P-ERK表達量隨藥物濃度的增加而降低。

3 討論

流式細胞儀檢測肯定了G-RH2誘導A549細胞凋亡的作用。阻滯細胞周期是誘導腫瘤細胞凋亡的方式之一， 其中最易受到影響的是分子變化最為活躍的G1-S期以及G2-M期， 藥物作用于這兩個時期就可以干擾細胞周期的運行， DNA合成受阻， 從而抑制細胞的增殖和生長[2]。本實驗結果顯示：G-RH2作用于A549細胞后， A549細胞G1期細胞依次增高， S期細胞則依次減少， G2期細胞無明顯變化， 提示G-RH2對于A549的細胞周期調節作用， 主要發生在G1期， 可將細胞周期阻滯在G1期， 阻止其向S期的發展。

在細胞凋亡過程中， Bcl-2家族起著非常重要的作用， 其誘導細胞的線粒體凋亡途徑。本研究中對Bcl-2家族主要研究Bax、Bcl-2、Bid的影響。Bcl-2是細胞凋亡的負調控因子， Bax起著促進細胞凋亡的作用， Bid可以接受細胞內的死亡信號[3]。Cyto-C是線粒體凋亡途徑的關鍵蛋白， 可反映Bcl-2家族蛋白對線粒體的調控作用[4]。本實驗分別以0～60 μmol的G-RH2作用A549細胞72 h后， 發現Bax、Bid及Cyto-C表達量隨藥物濃度增加而增加， Bcl-2表達量隨藥物濃度的增加而降低。

ERK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的一員， 參與細胞生長、繁殖、分裂、分化等各個方面， P-ERK即磷酸化的ERK可影響細胞增殖和調控[5]。本實驗中分別用0～60 μmol的G-RH2作用A549細胞72 h后， 結果發現ERK及P-ERK表達量隨藥物濃度的增加而降低。

綜上所述， G-RH2通過引發A549細胞G1期細胞周期阻滯， 抑制細胞增殖， 并通過下調Bcl-2的表達， 上調Bax及Bid的表達， 增加Cyto-C的釋放， 誘導A549細胞凋亡；也可能是通過下調P-ERK及ERK的表達抑制A549細胞增殖。

參考文獻

[1] 樸麗花， 金政， 蔡英蘭， 等.人參皂甙Rh2抗乳腺癌細胞細胞侵襲和轉移的實驗研究.中國臨床藥理學雜志， 2011， 27（11）： 867-870.

[2] Yi PF， Bi WY， Shen HQ， et al. Inhibitory effects of sulfated 20（S）-ginsenoside Rh2 on the release of pro-inflammatory mediators in LPS-induced RAW 264.7 cells. European Journal of Pharmacology， 2013， 712（1-3）：60-66.

[3] 史婷婷， 白建平， 梁月琴， 等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響.中國藥理學通報， 2011， 27（5）：666-670.

[4] Chang Z， Xing J， Yu X， et al. Curcumin induces osteosarcoma MG63 cells apoptosis via ROS/Cyto-C/Caspase-3 pathway. Tumour biology， 2014， 35（1）：753-758.

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[收稿日期：2015-12-04]