黃芩素對人結腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機制

王寧，程琦，張延新(漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002)

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黃芩素對人結腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機制

王寧，程琦，張延新(漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002)

摘要：目的探討黃芩素對人結腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及其作用機制。方法 取處于對數生長期的人結腸癌SW480細胞，隨機分為對照組,25、50、100 μmol/L黃芩素處理組，分別加入生理鹽水,25、50、100 μmol/L黃芩素處理，采用EdU、MTT、流式細胞術及Transwell小室實驗觀察黃芩素對結腸癌細胞增殖、凋亡及侵襲的影響，并通過Western blotting法檢測黃芩素干預后結腸癌細胞Bcl-2、Bax及VEGF蛋白表達。結果25、50、100 μmol/L黃芩素處理組SW480細胞增殖受到抑制，呈劑量、時間依賴性；25、50、100 μmol/L黃芩素處理組SW480細胞凋亡率依次升高；25、50、100 μmol/L黃芩素處理組SW480細胞的侵襲遷移能力降低；黃芩素干預后SW480細胞中Bcl-2、VEGF蛋白表達下調，Bax蛋白表達上調(P<0.05)。結論 黃芩素抑制人結腸癌細胞的增殖及侵襲，并促進其凋亡，機制可能與下調Bcl-2、VEGF蛋白表達并上調Bax蛋白表達有關。

關鍵詞：結腸腫瘤；黃芩素；細胞增殖；細胞凋亡；血管內皮生長因子

結腸癌已成為世界范圍內諸多國家惡性腫瘤高病死率的原因之一[1]，在發達國家每年影響人數超過一百萬人[2]。我國惡性腫瘤患者中，結腸癌的發病率和病死率均較高[3]。黃芩別名山茶根、土金茶根，歸于唇形科黃芩屬，為多年生草本植物，常以干燥根入藥。現代藥理研究發現其具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌及抗炎活性[4～6]。黃芩素是黃芩根中的主要黃酮類化學成分，有研究表明黃芩素能抑制人卵巢癌、膠質瘤和骨髓瘤細胞生長及誘導其細胞凋亡的作用[7,8]。然而有關黃芩素在人結腸癌細胞中的生物學功能研究較少。2014年9月～2015年5月，我們觀察黃芩素對人結腸癌細胞系SW480細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料人結腸癌細胞系SW480購于上海生物研究所，來源為人結腸低分化黏液腺癌。黃芩素、MTT 購自Sigma公司；EdU檢測試劑盒購自Invitrogen公司； Annexin V-FITC 試劑盒及蛋白提取試劑盒購自Calbiochem公司；DMEM培養基及胎牛血清購自Gibco公司；Transwell小室購自美國BD公司；兔抗人單克隆Bax、Bcl-2及VEGF抗體購自ABCam公司；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2細胞培養將SW480細胞常規培養于含10%小牛血清的DMEM培養基，并置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中進行培養。

1.3細胞增殖情況觀察收集對數期生長期的SW480細胞，調整濃度為5×104/mL的細胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板，5%CO2、37 ℃培養24 h。分別加入相應的黃芩素溶液并使其終濃度分別為25、50、100 μmol/L，設立空白對照，繼續培養24、48 h，每孔加入100 μL含有濃度為50 μmol/L的EdU培養基孵育2 h，然后加入100 μL的固定液進行固定。按照EdU檢測試劑盒的說明書進行EdU染色。隨后用Hoechst 33342進行細胞核復染。熒光顯微鏡下觀察并記錄。收集對數生長期的SW480細胞，調整為濃度為5×104/mL的細胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板，5% CO2、37 ℃培養24 h。分別加入相應的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50、100 μmol/L，設立空白對照。繼續培養12、24、36、48 h后，每孔加濃度為5 mg/mL的 MTT溶液 10 μL，孵育4 h后終止，振蕩15 min，選擇490 nm波長，于酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度OD值，繪制生長曲線。

1.4細胞凋亡率測算收集對數生長期的SW480細胞，調整濃度為5×104/mL的細胞懸液，按照每孔2 mL接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入相應的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50、100 μmol/L，設立空白對照，繼續培養48 h。按照說明書操作，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

1.5細胞侵襲遷移能力檢測進行Transwell遷移實驗。將Matrigel稀釋濃度為10 μg/μL后，包被Transwell小室，分隔成上下小室。將不同濃度黃芩素處理48 h后的SW480細胞調整濃度為1×105/mL，取200 μL加入上室，下室加入600 μL的完全培養基，5%CO2、37 ℃環境下培養10 h。取出Transwell小室，并用PBS濕潤，然后用棉球擦去上室表面黏附的細胞，PBS洗滌2次。將Transwell小室用4%甲醛溶液固定15 min，乙醇脫水，結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數上室遷移至微孔膜下層的細胞。

1.6血清Bcl-2、Bax及VEGF蛋白表達檢測采用免疫印跡Western blotting法檢測。將濃度為5×104/mL的SW480細胞懸液以2 mL/孔接種于6孔培養板中，終濃度分別為25、50、100 μmol/L的黃芩素處理48 h后，棄上清，按蛋白提取試劑盒說明進行蛋白提取，并測定其濃度。50 μg/孔總蛋白上樣，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜，封閉，洗滌，Bcl-2、Bax、VEGF、β-actin一抗孵育(1∶1 000)，4 ℃過夜，TBS洗滌3次，加入二抗(1∶5 000)孵育，洗滌，ECL顯色液顯色檢測蛋白的表達。

2結果

2.1黃芩素干預后結腸癌細胞增殖情況黃芩素處理24 h后，對照組、25、50、100 μmol/L每10×視野下黃芩素處理組處于S期的結腸癌細胞和該視野下全部細胞數比值分別為47/89、45/95、42/90、37/82，與對照組相比，100 μmol/L黃芩素處理組處于S期的細胞比例顯著降低(P<0.05)；經黃芩素處理48 h后，對照組、25、50、100 μmol/L黃芩素處理組每10×視野下黃芩素處理組處于S期的結腸癌細胞和該視野下全部細胞數比值分別為63/134、42/97、37/91、28/81，與對照組相比，100 μmol/L黃芩素處理組處于S期的細胞比例顯著降低(P<0.01)。黃芩素對SW480細胞生長有抑制作用，并呈劑量、時間依賴性。見圖1。

圖1　不同處理組SW480腫瘤細胞的生長曲線

2.2黃芩素干預后結腸癌細胞凋亡率對照組，25、50、100 μmol/L黃芩素處理組的細胞凋亡率分別為(6.71±0.85)%、(7.59±0.94)%、(8.57±0.64)%、(14.14±1.34)%。與對照組相比，50 μmol/L黃芩素處理組細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)，100 μmol/L黃芩素處理組的凋亡率明顯高于其他組(P均<0.01)。

2.3黃芩素干預后結腸癌細胞的侵襲遷移能力對照組，25、50、100 μmol/L黃芩素處理組侵襲到下層的細胞數分別為(112±11)%、(99±8)%、(90±12)%、(68±14)%。與對照組相比，25、50、100 μmol/L黃芩素處理組細胞遷移數量分別下降11.61%(P=0.105)、19.64%(P=0.035)、39.29%(P=0.003)。

2.4黃芩素對凋亡相關基因Bcl-2、Bax及VEGF表達的影響對照組，25、50、100 μmol/L黃芩素處理組中，Bcl-2的表達量分別為59.87±5.15、58.19±8.34、47.58±4.76、32.20±6.28；Bax表達量分別為19.68±5.76、31.57±5.83、34.23±6.75、42.47±7.02；VEGF的表達量分別為39.97±4.85、31.79±9.23、31.13±5.19、17.90±4.33。與對照組相比，50、100 μmol/L黃芩素處理組Bcl-2蛋白表達顯著低于對照組，Bax高于對照組(P<0.05)；100 μmol/L黃芩素處理組VEGF蛋白表達低于對照組(P<0.05)。

3討論

已有研究表明黃芩素可通過不同途徑抑制腫瘤細胞的增殖并誘導凋亡。黃芩素能抑制肝癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡[9]；黃芩素及其硫酸化衍生物能通過依賴ROS途徑誘導人乳腺癌細胞MCF-7發生凋亡[10]；黃芩素被廣泛用于血液系統的抗腫瘤研究，有一定抗血液系統腫瘤活性[11]；其亦能通過抑制胃癌細胞VEGF和HGF表達來抑制胃癌細胞的增殖與凋亡[12];此外黃芩素能抑制人胰腺癌 PANC-1細胞增殖，影響腫瘤細胞的偽足形成，導致細胞的侵襲力下降[13]。本研究結果表明黃芩素可通過抑制人結腸癌SW480細胞的DNA合成來抑制其增殖，并呈劑量、時間依賴性。流式細胞儀檢測結果表明黃芩素能促進SW480細胞凋亡。Transwell小室實驗提示黃芩素還能抑制SW480細胞的侵襲遷移能力。

Caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族是參與凋亡進程的兩個蛋白家族，前者負責凋亡的執行，后者調控線粒體的完整性[14]。Bcl-2保護細胞線粒體的完整性，抑制細胞色素C的釋放，而Bax在線粒體膜上形成多聚體影響其完整性，使線粒體釋放Caspase活化因子，誘導Caspase引起的細胞凋亡。Bcl-2蛋白家族所介導的細胞凋亡通路，不單是通過改變某個蛋白的表達水平來調控，而是通過改變促凋亡和抗凋亡蛋白的比例來實現。本研究結果顯示黃芩素可明顯增加Bax的表達，并抑制Bcl-2蛋白的表達，從而降低了Bcl-2/Bax 蛋白表達水平的比例，提示黃芩素促進SW480細胞凋亡可能與以線粒體為核心的凋亡途徑有關。

VEGF能通過與VEGF受體結合，刺激血管內皮細胞增殖、遷移并形成新生血管，與腫瘤細胞的侵襲遷移能力密切相關[15]。本研究中SW480經黃芩素處理48 h后，與對照組比較，VEGF蛋白表達減少，細胞增殖能力下降，凋亡細胞增多，細胞侵襲遷移能力下降，提示黃芩素可能通過抑制VEGF表達，降低SW480細胞的侵襲遷移能力，進一步影響腫瘤細胞的增殖和凋亡。

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Effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of human colorectal cancer cells

WANGNing,CHENGQi,ZHANGYanxin

(LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of human colorectal cancer cells and to explore the mechanism. MethodsHuman colorectal cancer cells SW480 in logarithmic phase were randomly divided into the control group, 25, 50 and 100 μmol/L baicalein treatment groups which were respectively treated with normal saline, 25, 50 and 100 μmol/L baicalein. The effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of SW480 cells were detected by EdU, MTT, flow cytometry and Transwell test. The protein expression of Bcl-2, Bax and vascular endothelial growth factor (VEGF) in SW480 cells after the treatment of baicalein was detected by Western blotting.ResultsIn the 25, 50 and 100 μmol/L baicalein treatment groups, the proliferation of SW480 cells was inhibited with a dose and time-dependent manner, the apoptosis rates of SW480 cells were gradually increased, and the invasion abilities of SW480 cells were gradually decreased. After the treatment of baicalein, the expression of Bcl-2 and VEGF in SW480 cells was down-regulated, and the expression of Bax was up-regulated (P<0.05). ConclusionBaicalein inhibits the proliferation and invasion of SW480 cells and promots the apoptosis, which might be related with the down-regulation of Bcl-2 and VEGF expression and the up-regulation of Bax expression.

Key words:colorectal neoplasms; baicalein; cell proliferation; apoptosis; vascular endothelial growth factor

(收稿日期：2015-09-20)

中圖分類號：R735.35

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)13-0010-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.004

第一作者簡介：王寧(1983-)，男，碩士，講師，主要研究方向為腫瘤病理與腫瘤細胞生物學。E-mail:wntot@126.com

基金項目：河南省教育廳青年教師資助項目(2012GGJS-269)；漯河醫學高等專科學校科學研究項目(2010S06)。