RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多態性與兒童哮喘易感性的關系

于美麗,馬兆越(煙臺毓璜頂醫院,山東煙臺64000；日照市人民醫院)

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RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多態性與兒童哮喘易感性的關系

于美麗1,馬兆越2(1煙臺毓璜頂醫院,山東煙臺264000；2日照市人民醫院)

摘要：目的探討RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多態性與兒童哮喘發病風險的關系。方法 采用病例-對照的研究方法，對入組的80例哮喘兒童(哮喘組)和80例健康兒童(對照組)應用質譜SNP技術，研究RAD50基因位點rs6871536、CDHR3基因位點rs 6967330、CYP27B1基因位點rs10877012的單核苷酸多態性，計算其基因型頻率和等位基因頻率，并分析基因位點的多態性與兒童哮喘發病風險間的關系。結果哮喘組與對照組rs6871536位點基因型及等位基因頻率差異均有統計學意義(P均<0.05)；哮喘組與對照組rs6967330、rs10877012基因型比較差異無統計學意義(P均>0.05)。突變等位基因C、T與哮喘有相關性，TT、CC型的OR(95%CI)分別為0.407(0.231～0.718)、0.677(0.546～0.839)。結論 RAD50基因rs6871536位點多態性可能與兒童哮喘相關；CDHR3基因rs 6967330位點多態性和CYP27B1基因位點rs10877012位點多態性可能與兒童哮喘無相關性。

關鍵詞：哮喘；基因多態性；RAD50；CDHR3；CYP27B1

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種常見病、多發病，尤其是在兒童人群之中，其發病率與病死率不斷上升。目前支氣管哮喘的發病原因及機制尚未完全明確，但眾多學者們認為支氣管哮喘是一種由環境因素和遺傳因素共同參與的Ⅰ型超敏反應性疾病[1]。隨著社會的進步，遺傳學與分子生物學的不斷成熟，人們將對疾病病因研究的重點逐漸聚焦到基因水平，哮喘是一種多基因復雜性疾病，近年來有關哮喘易感基因的研究越來越多[2～5]。CDHR3基因、CYP27B1基因、RAD50基因是近年來眾多專家較為關注的與哮喘易感性相關的基因。2013年3月～2014年10月,我們選取CDHR3基因rs 6967330位點、CYP27B1基因位點rs10877012、RAD50基因rs6871536位點進行多態性研究，以期為哮喘的預防與治療提供新的思路。

1資料與方法

1.1臨床資料哮喘患兒80例(哮喘組)，男49例、女31例，年齡(7.94±2.11)歲。哮喘患兒均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》診斷標準[6]。同時收集在煙臺毓璜頂醫院兒科門診體檢中心體檢的健康兒童80例為對照組，男43例、女37例，年齡(8.23±2.17)歲。對照組兒童及三代以內直系親屬均無哮喘病史及典型的過敏性疾病病史。兩組研究對象均來自煙臺地區，相互間無血緣關系。兩組對象均為漢族，性別、年齡構成差異均無統計學意義。

1.2RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多態性檢測方法對哮喘患兒及健康兒童均采集肘靜脈血3 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血清后置于EP管中，然后嚴格按照血液基因組DNA提取試劑盒說明進行DNA提取，試劑盒來自北京天根生化科技有限公司。根據文獻，在美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站上查詢包括相應位點的一段基因序列，確定其突變位點后進行引物設計，該過程由北京六合華大基因科技有限公司深圳分公司完成。

1.3統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。經校正性別和年齡的影響后，計算每個SNP位點的基因型和等位基因頻率分布，Hardy-Weinberg平衡檢測用精確檢驗，哮喘組和對照組基因型和等位基因頻率分布比較采用卡方檢驗，采用Logistic回歸分析來計算其OR和95%CI。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

在校正性別和年齡的影響后，經精確檢驗，哮喘組與對照組CDHR3、CYP27B1、RAD50基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0．05)，表明其基因頻率已達到遺傳平衡，具有群體代表性。

經統計學分析，RAD50位點rs6871536、CDHR3位點rs 6967330、CYP27B1位點rs10877012的基因型與等位基因頻率分布分別見表1、2、3。哮喘組與對照組CDHR3位點rs 6967330和CYP27B1位點rs 10877012的基因型及等位基因頻率差異無統計學意義(χ2=2.209，P=0.363；χ2=2.737，P=0.254)。哮喘組與對照組RAD50位點rs6871536位點基因型及等位基因頻率差異均有統計學意義(χ2=7.931，P=0.019；χ2=9.986，P=0.002)，突變等位基因C、T與哮喘有相關性，TT、CC型的OR(95%CI)分別為0.407(0.231～0.718)、0.677(0.546～0.839)。

表1　兩組rs6871536 位點基因型與等位基因頻率比較[例(%)]

表2　兩組rs6967330位點基因型與等位基因頻率比較[例(%)]

表3　兩組rs10877012位點基因型與等位基因頻率比較[例(%)]

3討論

支氣管哮喘是一種多基因參與的復雜性疾病，具有高度明顯的遺傳性[7]。有研究發現，如果父親或母親一方患有支氣管哮喘，孩子患哮喘的危險程度比無哮喘家庭的孩子高，如果父母均患有哮喘，則孩子患病的風險更大[8]。目前支氣管哮喘的發病率與病死率不斷上升，發現與哮喘相關的易感基因，深入研究其發病機理，可為哮喘的預防和治療提供新的靶點。

支氣管哮喘是一種Ⅰ型變態反應性疾病，在特異性抗原的刺激下，IgE與肥大細胞、嗜酸性、嗜堿性粒細胞上的特異性受體結合后，釋放大量的炎癥介質，引起支氣管平滑肌的痙攣，毛細血管通透性增加等變態反應，最終導致哮喘的發生[9]。第三次全基因組關聯分析新發現了一個與總IgE相關的基因-RAD50[10]，該基因位于染色體的5q31.1區域，這一區域與白細胞介素等與哮喘相關的細胞因子基因區域接近[11]。RAD50是一種DNA修復蛋白，能與DNA結合并能檢測其有缺陷的部位，其能調控相鄰的幾個白細胞介素基因的表達[12]。本研究我們選擇RAD50基因的rs6871536 位點作為研究對象，探討煙臺地區RAD50基因多態性和支氣管哮喘發病危險性間的關系，結果顯示在哮喘組和對照組中，rs6871536 位點的基因型和等位基因型頻率比較差異有統計學意義，表明RAD50基因rs6871536 位點的多態性可能與煙臺地區的兒童支氣管哮喘發病風險有關。

已有研究[13]發現，鈣黏蛋白家族如上皮細胞鈣黏蛋白、原鈣黏素介導的細胞受體等與支氣管哮喘有明顯的相關性。哥本哈根大學進行的一項研究，通過篩查兒童的DNA，發現了在極早期哮喘形成中起重要作用的基因-CDHR3，該基因定位于染色體的7q22.3區域,是最新發現與支氣管哮喘發病風險有關的基因[14]。CDHR3是一種包含六個外鈣黏蛋白結構域的跨膜蛋白，其可介導同源性細胞的黏附，參與細胞分化、細胞間相互作用等過程[15]。其中鈣黏蛋白結構域D5與D6間的兩個半胱氨酸529和566由于與這兩個結構域的距離較短，相互之間的作用會使二硫鍵發生重組，形成野生型的半胱氨酸突變體[14]。該變體的殘基有可能會破壞蛋白質的結構及穩定性，因此這可能是CDHR3參與支氣管哮喘發病的主要機制。rs6967330位點位于CDHR3基因的最頂端，由于半胱氨酸529的等位基因發生了A-G突變，導致基因序列和基因型均發生了變化，該位置編碼的氨基酸由半胱氨酸突變成了酪氨酸。本研究結果發現，在哮喘組和對照組中，CDHR3基因rs6967330位點的基因型和等位基因型頻率的分布差異無統計學意義，表明CDHR3基因rs6967330位點的多態性與煙臺地區兒童支氣管哮喘的易感性無明顯相關性。

近年來，越來越多的研究表明維生素D與支氣管哮喘間存在明顯相關性[16]。但維生素D必須轉化為其活性形式1,25二羥維生素D3才能發揮其生物學作用[17]。1α羥化酶是維生素D活化過程中的關鍵酶，由CYP27B1編碼。染色體的12q13.1-13.3區域是CYP27B1基因的所在位置，位于啟動子區域的基因位點rs10877012可發生G-T突變，導致該基因的序列發生改變，進而影響CYP27B1基因的表達，體內1,25(OH)2D3的水平發生改變，導致與維生素D缺乏有關的疾病如支氣管哮喘等的發生。本研究結果表明，rs10877012位點與支氣管哮喘的發病風險間無明顯相關性，這可能是由于該位點的G-T突變為同種意義的突變，基因的表達并未受到影響。

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(收稿日期：2015-11-27)

中圖分類號：R256.12

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)13-0059-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.023