脂肪酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ925.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5774（2025）02-0155-07

Isolation and identification of lipase producing bacteria and optimization of enzyme-producing conditions

Li Guofeng ^1，2 +， Zhou Shiwen ^1，2 +， Cheng Junqiu ^1，2 ?，Li Zunwen ^1，3 ， Jiang Ran4， HongYingqi 3，XuQiaoling5，YeWei1，3*

（1.Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Innovative Utilization in Fujian Province，Sanming， Fujian 365509，China； 2.Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 35ooO2， China; 3.Institute of Medicinal Plants，Sanming Academyof Agricultural Sciences，Sanming，F(xiàn)ujian 3655o9，China; 4.FuJian WeLike Pharma Co.，Ltd， Sanming，F(xiàn)ujian 365509，China; 5.Gansu Third People'sHospital，Lanzhou， Gansu 730O20， China）

Abstract：【Objective】The purposeof this experiment is to screen lipase producing bacteriaand studytheir enzyme producing ability.【Method】Thesoil samples which had been contaminated byoil pollution foralong time，wereenriched and cultured，and the strains were isolatedandscreened by Rhodamine Bplate method.The shaking tableculture with peanutoilas theonlycarbonsourcewas used to explore the enzyme production parametersof theselected strains.The lipase production conditions of each strain weresystematicallyoptimized.【Result】Three strains with high enzyme production ability were obtainedusing Rhodamine B plate methodand namedasLN2，Bk3andBd4.Throughbymorphologicaland16S rRNAmolecular identification，LN2wasPseudomonasaeruginosa，Bk3was Burkholderiavietnamiensisand Bd4 was Acinetobacter soil.After 48 hours of cultivation，the optimal temperature for the three strains is 30～40% ，and the optimal culture pH is 7.O .Through comprehensive screening，the enzyme activity of LN2 was found to be 1.25U/mL at 30% and pH 7.0; the enzyme activity of Bk3 was O.85 U/mL at 40% and pH 7.O; and the enzyme activity of Bd4 was 3.13 U/mL at 30% and pH7.0.【Conclusion】The three lipaseproducing bacteria showed excellent potential in lipaseproduction，especially Bd4， which provided candidate strain materials for the industrial application of lipase.

Keywords：lipase; Pseudomonas aeruginosa; Burkholderia vietnamiensis; Acinetobacter soil; optimal temperature

脂肪酶是自然界中普遍存在的水解酶類，能促進(jìn)脂肪分解為甘油與脂肪酸，且在非水相體系中展現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性[1-2]。天然脂肪酶具有顯著的溫和性、環(huán)境友好性及經(jīng)濟(jì)性，已在多個(gè)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用，包括但不限于醫(yī)學(xué)、食品加工、皮革制造、飼料生產(chǎn)、洗滌劑配制及油脂分解等，并且在生物柴油制備、廢棄食用油回收等前沿領(lǐng)域展現(xiàn)出重要的應(yīng)用潛力[1-2]。天然脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物胰腺組織、植物種子內(nèi)部以及多種微生物中。由于動(dòng)物胰腺和植物種子中的脂肪酶較難提取且不易保存，而微生物所產(chǎn)脂肪酶多為分泌型，具有易于規(guī)模化生產(chǎn)和高純樣品制備、溫度適應(yīng)性強(qiáng)[3-4]、 pH 適應(yīng)性強(qiáng)[5-7]、生產(chǎn)成本低和不受季節(jié)波動(dòng)[8]等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種重要的化學(xué)工業(yè)原料[9]。

自然界中存在多種產(chǎn)脂肪酶微生物，涵蓋了細(xì)菌、真菌、放線菌以及酵母菌等多個(gè)大類，約65種不同的菌屬[9-10]。由于不同菌分泌的脂肪酶在作用溫度、pH、底物特性和應(yīng)用領(lǐng)域存在較大差異，不斷發(fā)掘脂肪酶產(chǎn)生菌具有重要意義[10-11]。相較真菌而言，細(xì)菌是一類物種豐富、數(shù)量龐大的微生物類群，其結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單，更適合在后續(xù)的研究中進(jìn)行改造，以獲取更高產(chǎn)酶能力的菌株，是最主要的分離目標(biāo)之一[12]。此外，在常溫條件下具有較高脂肪酶活力菌株在工業(yè)合成及環(huán)境治理方面更具有高效、節(jié)能等特點(diǎn)，亦是主要的目標(biāo)篩選菌種。

鑒于此，為分離常溫條件下具有高脂肪酶生產(chǎn)效率的菌株，本研究以福建夏季室外的油污污染土壤作為研究材料，并通過一系列的溫度及pH值等培養(yǎng)條件對(duì)比，篩選常溫條件下具有高效脂肪酶生產(chǎn)能力的菌株，優(yōu)化菌株發(fā)酵及產(chǎn)脂肪酶條件。本研究可為脂肪酶工廠化應(yīng)用提供候選菌種材料，并為后續(xù)的產(chǎn)脂肪酶菌株研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)及技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料

土樣采自福建省三明市沙縣常年被廢油污染的土壤（ 26^°34^′28^′′N ， 117^°45^′2^′′E ），每份土樣采集約 0.5kg ，共6份，使用離心管包裝后，置于 4^°C 條件備用。

富集培養(yǎng)基[13]： 2.5g/L 酵母粉， 11g/L 花生 油， 3.5g/L KH₂PO₄ ， 1.2g/LNa₂HPO₄ ， 0.6g/L MgSO₄?7H₂O ， pH 值調(diào)至 7.0 。

初篩培養(yǎng)基[13]： 20g/L 花生油乳化液， 2.5g/L 酵母粉， 0.005g/L 羅丹明B， 3g/L 瓊脂， 0.05g/L NaCl， 0.15g/L （20 KH₂PO₄ ，0.35 g/L Na₂HPO₄ ， 2g/L （NH₄）₂SO₄ ， pH 值調(diào)至 7.0 。

種子液培養(yǎng)基[13]： 1g/LK₂HPO₄ ， 3g/L NaCl，2g/L 蛋白脈， 2.5g/L 葡萄糖， 2g/L 酵母粉， pH 值調(diào)至7.0。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[13]： 1g/L 三 （NH₄）₂SO₄ ， 1g/L MgSO₄?7H₂O ，1g/L KH₂PO₄ ， 2g/L 蛋白脈， 2.5g/L 葡萄糖， pH 值調(diào)至7.0。

花生油聚乙烯醇乳化液[13]：花生油與 2% 聚乙烯醇（PVA）以1：3的比例（V/V）混合，使用磁力攪拌器攪拌 5min 后，超聲波處理 5min ，至液體呈現(xiàn)均勻乳白色粘稠狀，即成花生油聚乙烯醇乳化液。

1.2方法

1.2.1脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

1.2.1.1菌種富集培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[13]，每份土樣稱取 7.5g ，加入滅菌后的錐形瓶中，并加入 25mL 無菌水，封口后室溫下?lián)u床振蕩 10min ，靜置 10min ，制成土壤懸液。以 5% 的接種量加入 100mL 富集培養(yǎng)基中，于 30% 恒溫下?lián)u床振蕩培養(yǎng) 72h 。富集培養(yǎng)3次。

1.2.1.2初篩培養(yǎng)

利用羅丹明B平板法進(jìn)行初篩培養(yǎng)，以 10% 的接種量添加過濾除菌的羅丹明B至已滅菌的初篩培養(yǎng)基中，倒平板。采用梯度稀釋法，將 1mL 上述富集培養(yǎng)液用無菌水稀釋至原濃度的 10^-6 倍，并將稀釋液均勻涂布于初篩培養(yǎng)基平板上。將平板置于 35^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，置于 350nm 紫外光下觀察菌落，可見脂肪酶產(chǎn)生菌的菌落周圍會(huì)存在明亮的熒光圈，且該熒光圈的直徑直接反映菌株分解脂肪的能力，直徑越大表明產(chǎn)脂肪酶酶活性越高。以平板上熒光圈直徑的大小為依據(jù)，初步篩選產(chǎn)酶能力高的菌株[13]

1.2.1.3復(fù)篩培養(yǎng)

從初篩培養(yǎng)基上挑選出熒光圈較大的菌落，通過平板劃線法，分離獲得純菌株，并采用甘油凍藏法保持各純菌株。分純的菌株轉(zhuǎn)接至 50mL 種子液培養(yǎng)基內(nèi)，于不同溫度下 180r/min 培養(yǎng) 24h 。隨后，向一組具 pH 值梯度的 50mL 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別接種 5mL 菌液，在不同溫度梯度下培養(yǎng)72h 。取 40mL 發(fā)酵液， 4000r/min 離心 10min ，取10mL 上清液即為粗酶液，用于后續(xù)酶活力測(cè)定[14]。將不同菌株在種子液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌液稀釋10倍后，進(jìn)行革蘭氏染色，于100倍顯微鏡下觀察并記錄菌株形態(tài)，測(cè)量其形態(tài)大小。

1.2.2菌株的生物學(xué)鑒定

提取各待測(cè)菌株的DNA，PCR擴(kuò)增16SrDNA[15]。擴(kuò)增引物為上生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)，其序列如下：27F： 5^′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- ?3^′ ；1492R： 5^′ -GGTTACCTTGTTACGACTT- ?3^′

PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系（ 50μL ）如下： 2×PCR Taq M25μL ；引物F（ 10μmol/L ） 2μL ；引物R（ 10μmol/L ） 2μL ；DNA模板 4μL ; PCR反應(yīng)循環(huán)體系如下： 94^°C 預(yù)變性 3min ； 94^°C 變性 1min ， 50% 退火 30s ， 72% 延伸 2.5min ，重復(fù)30個(gè)循環(huán)； 72% 延伸 10min 。

反應(yīng)結(jié)束后，取 5μL PCR產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度，并收集含有電泳分純后的PCR產(chǎn)物的凝膠塊[16-20]

擴(kuò)增得到的產(chǎn)物交由生工生物工程（廈門）有限公司進(jìn)行測(cè)序和拼接。將測(cè)得的序列提交至NCBI平臺(tái)進(jìn)行BLAST序列同源性比對(duì)，下載參考序列，采用MEGA11.0軟件，運(yùn)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]

1.2.3酶活力測(cè)定

將發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基調(diào)至不同的 pH ，并于不同溫度下分別培養(yǎng)菌株， 48h 后測(cè)定各組合脂肪酶活力。采用花生油聚乙烯醇乳化液法測(cè)定脂肪酶活力[22]。其中脂肪酶活力單位是指在 30^°C 條件下，若一定量的脂肪酶能在 10min 內(nèi)催化油脂水解，每 min 產(chǎn)生 1μmol 的脂肪酸，則此量的脂肪酶為一個(gè)國(guó)際單位的酶活力（ U/mL 。

1.2.4產(chǎn)酶條件參數(shù)優(yōu)化

采用單因素與多因素相結(jié)合的方法分析菌株產(chǎn)脂肪酶的條件。首先實(shí)施單因素試驗(yàn)，設(shè)置不同的發(fā)酵起始 pH 與發(fā)酵溫度，探究環(huán)境因素對(duì)目標(biāo)菌株產(chǎn)酶能力的影響。再根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵起始 pH 和發(fā)酵溫度設(shè)計(jì)包含兩個(gè)因素、發(fā)酵溫度4個(gè)水平、 pH 值5個(gè)水平，共20個(gè)參數(shù)組合的正交試驗(yàn)方案（表1），確定最佳的酶生產(chǎn)條件[23]。

2結(jié)果與分析

2.1脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

經(jīng)菌種富集培養(yǎng)和羅丹明B平板法初篩培養(yǎng)后，得到20株菌株，從中找到6株在 350nm 紫外光照射下出現(xiàn)熒光圈的菌株，選取3株有較大熒光圈的菌株LN2、Bk3和Bd4。其中LN2呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光（圖1A），顯微鏡下呈紫紅色長(zhǎng)棒狀，長(zhǎng)度3.5～9.4μm ，平均 7.88μm ；Bk3菌株在羅丹明B培養(yǎng)基上呈現(xiàn)橙黃色熒光（圖1B），顯微鏡下菌株為紫紅色短棒狀，長(zhǎng)度 8.6～13.1μm ，平均12.15μm ；Bd4菌株呈現(xiàn)橙黃色熒光（圖1C），顯微鏡下呈藍(lán)紫色短橢圓狀，長(zhǎng)度 5.7～14.6μm ，平均 12.90μm 。

注：A，LN2菌落形態(tài)與顯微照片；B，Bk3菌落形態(tài)與顯微照 片；C，Bd4菌落形態(tài)與顯微照片。

Note：A，Colonymorphology and micrograph of LN2;B，Colony morphology and micrograph of Bk3;C，Colony morphologyand micrograph of Bd4.

2.2脂肪酶產(chǎn)生菌的分子生物學(xué)鑒定

通過PCR擴(kuò)增，獲得LN2、Bk3和Bd4菌株的16s rRNA序列長(zhǎng)度分別為1396、1396和1391bp，序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)：PV123189、PQ311711和PV123194（表2）。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)（表2），3株菌株分別與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、越南伯克霍爾德氏菌（Burkholderiavietnamiensis）和土壤不動(dòng)桿菌（Acinetobactersoil）最為相似。通過與其他近緣菌株16srRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)合外觀鑒定與分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明LN2為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），Bk3為越南伯克霍爾德氏菌（Burkholderiavietnam-iensis），Bd4為土壤不動(dòng)桿菌（Acinetobactersoil）。

2.3發(fā)酵起始pH和溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1發(fā)酵起始pH對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

酶活力測(cè)定結(jié)果表明（表3），3株菌株隨著pH 值的升高，酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵起始pH值為7.0時(shí)呈現(xiàn)出最大的酶活力，pH為8.5時(shí)酶活力最小。LN2的適宜起始pH值為6.5和7.0，二者差異不顯著，酶活力均為 1.02U/mL Bk3適宜起始 pH 值為7.0，酶活力為 0.64U/mL ，與其余 pH 條件下酶活力差異顯著；Bd4最適起始 pH 值為7.0，酶活力為 2.68U/mL ，與 pH 為6.5時(shí)差異不顯著。

表3發(fā)酵起始pH對(duì)3菌株產(chǎn)脂肪酶能力的影響

2.3.2發(fā)酵溫度對(duì)3種菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

酶活測(cè)定結(jié)果表明 （表4），發(fā)酵溫度對(duì)3株菌株表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，LN2在 30% 時(shí)酶活力最高為 1.03U/mL ，與 25^°C 時(shí)的酶活力差異不顯著，并隨著溫度的上升表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)；Bk3隨著溫度的上升，其酶活力呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在 40% 時(shí)酶活力最高為 0.72U/mL ；Bd4在 30^°C 時(shí)酶活力最高，為 2.97U/mL ，其他溫度條件下酶活力差異不顯著；以上結(jié)果表明 30^°C 為菌株LN2和Bd4的產(chǎn)酶最適溫度， 40% 是Bk3產(chǎn)酶最適溫度。

2.4不同發(fā)酵起始pH值和發(fā)酵溫度組合對(duì)3菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

由表5、表6分析可知，LN2試驗(yàn)中，當(dāng)發(fā)酵起始 pH 值為7.0時(shí)（A2），發(fā)酵溫度為 30% （B2）時(shí)，通過正交試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，其酶活力平均值均為最大值，且發(fā)酵溫度（B）的極差大于發(fā)酵起始pH 值（A）的極差，因此，LN2的最優(yōu)方案為A2B2，溫度影響大于 pH 值；Bk3試驗(yàn)中，當(dāng)發(fā)酵起始pH值為7.0時(shí)（A2），發(fā)酵溫度為 40% （B4）時(shí)，通過正交試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，其酶活力平均值均為最大值，且發(fā)酵溫度（B）的極差大于發(fā)酵起始pH 值（A）的極差，因此，Bk3的最優(yōu)方案為A2B4，溫度影響同樣大于 pH 值；Bd4試驗(yàn)中，當(dāng)發(fā)酵起始pH值為7.0時(shí)（A2），發(fā)酵溫度為 30% （B2）時(shí)，通過正交試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，其酶活力平均值均為最大值，且溫度（B）的極差大于 pH 值（A）的極差，因此，Bd4的最優(yōu)方案為A2B2，溫度影響同樣大于pH值。

綜合以上分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度（B）是3種脂肪酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶能力的主要影響因素，其中LN2和Bd4菌株最適發(fā)酵溫度均為 30% ，Bk3最適溫度為 40^°C ，3株菌株最適發(fā)酵起始 pH 值均為7。LN2和Bd4最優(yōu)方案均為A2B2，Bk3最優(yōu)方案為A2B4。

3小結(jié)與討論

本研究采用羅丹明B平板法，從油污土壤中分離并篩選出了3株具備顯著脂肪酶生產(chǎn)潛能的菌株，并分別命名LN2、Bk3與Bd4，3株菌株分別鑒定為銅綠假單胞菌、越南伯克霍爾德菌和土壤不動(dòng)桿菌。在3株菌株中Bd4菌株展現(xiàn)出了較高的產(chǎn)酶活性，在發(fā)酵溫度 30% 、起始 pH 值7.0條件下培養(yǎng) 48h 后，酶活力水平達(dá)到 3.13U/mL ，這一結(jié)果提示Bd4具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用研究的價(jià)值。李春冬等[24]應(yīng)用同屬鮑曼不動(dòng)桿菌（A.baumannii），在搖床 37% 液體培養(yǎng) 24h 后，初始酶活性達(dá)到4.00U/mL ；張傳麗等[25]所篩選的約氏不動(dòng)桿菌，經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化后酶活力可達(dá) 22.7U/mL 。目前還未見關(guān)于土壤不動(dòng)桿菌生產(chǎn)脂肪酶能力的相關(guān)報(bào)道。后續(xù)可以進(jìn)一步優(yōu)化Bd4的發(fā)酵工藝流程，或通過基因工程手段對(duì)其進(jìn)行改造，從而更大限度的發(fā)揮其高產(chǎn)特性。

Bk3菌株的產(chǎn)酶活性雖相對(duì)較低，但其對(duì)較高溫度（ 40^°C ）有比較好的耐性，這與白鳳麟等[26]、柏曉輝等[27]所篩選出的產(chǎn)脂肪酶的伯克霍爾德氏菌的特性相同，使其在特定工業(yè)環(huán)境下具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Bk3產(chǎn)酶能力受限的原因可能不僅限于其固有的生物學(xué)特性，也可能是尚未探索到的最優(yōu)發(fā)酵條件。通過進(jìn)一步微調(diào)發(fā)酵參數(shù)或采用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改良，有望提升Bk3的產(chǎn)酶效率，并開發(fā)出耐高溫的脂肪酶產(chǎn)品。

前人[28-34]對(duì)產(chǎn)脂肪酶的銅綠假單胞菌進(jìn)行了深入研究。在本試驗(yàn)條件下，銅綠假單胞桿菌LN2產(chǎn)酶性能不及Bd4，高溫耐性亦不及Bk3。LN2菌株的獨(dú)特之處在于其無需添加其它物質(zhì)，便能在350nm 紫外光照射下發(fā)出綠色熒光，這一特性為監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)狀態(tài)及檢測(cè)下游產(chǎn)品中菌體的去除情況提供了便捷的檢測(cè)手段。

本研究中篩選出的土壤不動(dòng)桿菌Bd4，在既定試驗(yàn)條件下展現(xiàn)出的脂肪酶生產(chǎn)能力較已報(bào)道的同類菌株[35]具有一定優(yōu)勢(shì)，預(yù)示著其作為新型脂肪酶生產(chǎn)菌株的巨大潛力。通過持續(xù)探索和應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，如基因編輯與蛋白質(zhì)工程，對(duì)Bd4進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化與改造，有望推動(dòng)脂肪酶在食品加工、洗滌劑制造、污水處理、生物燃料合成等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，從而為實(shí)現(xiàn)綠色、可持續(xù)的工業(yè)發(fā)展貢獻(xiàn)力量[36-37]。

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（責(zé)任編輯：許玲）