牧區醪糟中微生物分離鑒定及耐受性、產酶特性的研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.07.015

中圖分類號：TS201.3 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）07-0104-04

lsolation and ldentification of Microoganisms from Fermented Glutinous Rice in Pastoral Area and Study on Their Tolerance and Enzyme Production Characteristics

LIU Hong-wei1'2， ZHANG Mei-li2 * （1.Hetao College，Bayannur O15ooo， China; 2. College of Food Science and Engineering， InnerMongolia Agricultural University，Hohhot Olool8，China）

Abstract：With fermented glutinous rice in the pastoral area of Ordos region as the test material，the dominant microorganisms in it are isolated and purified，physiological and biochemical identification is conducted，and their tolerance and enzyme production characteristics are studied. The results show that three strains of Brevibacterium casei （LZl #， LZ2# and ）and three strains of Bacillus subtilis （ ， LZ4# and ）are isolated from fermented glutinous rice in the pastoral area. The six strains isolated from fermented glutinous rice can all grow at 65^°C and have good high-temperature resistance characteristics. LZ3#， LZ4? and LZ6# have good salt tolerance. LZl #， LZ3# and LZ5# can produce amylase，and all the six strains can produce protease and lipase. The research results are expected to provide eficient fermentation agents and enzyme preparations for the rapid fermentation and quality control of fermented glutinous rice in the pastoral area.

Key words： fermented glutinous rice in pastoral area；microoganisms；resistance；enzyme production characteristics

發酵食品具有悠久的歷史，微生物發酵賦予食品優良的味道、香氣、質地、營養特性和功能活性。發酵是增強農畜產品貨架期的有效手段之一。微生物是食品發酵的動力源泉，微生物及其產生的相應酶類能夠通過酸化作用、乙醇發酵、蛋白質水解或氨基酸轉化等途徑增強產品的貨架期和感官品質，直接影響發酵食品的品質[1]。醪糟是一種以復合菌種為發酵劑制得的傳統發酵飲品，與東南亞、非洲等發展中國家的一些發酵飲品極為相似，因其味美可口而廣受喜愛[2]。傳統醪糟以糯米為主要原料，因糯米的別稱為江米或酒米，故醪糟有甜酒釀等多種別名[3]。與傳統的醪糟不同，牧區醪糟是先將發芽后的燕麥、玉米、小麥等谷物磨成粉制成自制曲，然后以黃米面等為原料充分將其熬熟糊化，再加入自制曲和高度糧食酒，利用環境中的微生物（主要是根霉菌、乳酸菌和酵母菌）自然發酵而成，是一種具有少數民族地方特色的食品，與晉陜地區的“酸食\"異曲同工，其口味香醇、甜酸適口[4-5]。傳統的工藝傳承及特定的區域環境，一定程度上是對相關微生物的定向馴化與選擇，也正是因此才形成了我國多種區域性醪糟制品。

傳統食品發酵體系中，微生物是發酵食品的“靈魂”，與發酵食品的工藝、風味等直接相關。牧區醪糟作為特定區域的傳統谷物發酵食品，多為家庭式或小作坊式生產，不同批次產品品質不穩定，難以工業化生產，因此了解牧區醪糟優勢微生物、對牧區醪糟中發酵微生物進行種質資源開發能更好地滿足牧區醪糟的發展需求。本研究以鄂爾多斯牧區醪糟為供試材料，對牧區醪糟的優勢微生物進行分離鑒定并研究其耐受性和產酶特性，旨在為穩定并提高牧區醪糟純種發酵、品質調控、產品開發提供基礎和保障。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源牧區醪糟：取自鄂爾多斯地區，冷藏備用。

1.1. 2 儀器與設備

DL-CJ-1NHDL-潔凈工作臺北京東聯哈爾儀器制造有限公司；PB-3O普及型pH計德國賽多利斯公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱上海捷呈實驗儀器有限公司；SX-300 高壓蒸汽滅菌器Tomy股份有限公司；BSA124S萬分之一電子天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.1. 3 培養基

分離培養基：牛肉膏蛋白脈培養基、MRS培養基、霉菌培養基、孟加拉紅培養基；產脂肪酶鑒別培養基：參照伍朝亞等研究中的初篩培養基；產淀粉酶鑒別培養基8：可溶性淀粉培養基；產蛋白酶鑒別培養基：參照陳明霞等[9研究中的初篩培養基。

盧戈氏碘液的配制：分別用天平稱取碘化鉀 2.0g 、碘片 1.0g ，用少量水先將碘化鉀溶解，再將碘片溶解于碘化鉀溶液中，待完全溶解后，用去離子水補足。

1.2方法

1.2.1 菌種分離、純化

微生物的分離采用稀釋平板涂布法。將12份醪糟樣品分別稱取 500g ，充分混勻，取 25g 混合樣品置于 225mL 滅菌生理鹽水中混勻，制備成菌懸液，采用梯度稀釋法稀釋至 10^-6 倍，選取 1.0mL10^-4 10^-5 .10^-6 倍的稀釋菌液接種于無菌培養血中，分別傾注營養瓊脂培養基、MRS培養基、霉菌培養基、孟加拉紅培養基于接種菌液的培養皿中，細菌分離培養基培養皿于37^°C 倒置培養 ^48h ，乳酸菌分離培養基培養皿于 32^°C 倒 置培養 ^48h ，霉菌和酵母菌培養皿于 30^°C 恒溫恒濕培養 箱中正置培養5d[10]。

培養結束后，觀察并挑選菌落形態不同的單菌落進行分離純化（挑起單菌落多次劃線純培養操作，至平板菌落形態單一為正），將分離純化得到的菌株進行編號并轉接于相應的斜面培養基中 4^°C 保存備用。

1.2.2 菌落形態特征觀察

宏觀形態觀察：細菌、乳酸菌、酵母菌等分離純化培養結束，觀察單一菌落的形態特征。

微觀形態觀察：用接種環挑取少許細菌、乳酸菌菌落，制成水浸片，在 10×100 倍油鏡下進行觀察；用接種環挑取少許酵母菌菌落，制成水浸片，在 10×40 倍油鏡下進行觀察。

1.2.3 生理生化試驗[11-12]

根據《常見細菌系統鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》，對所篩選的醪糟分離菌進行形態學特征和生理生化鑒定。

乳酸菌鑒定：通過革蘭氏染色、接觸酶、氧化酶、運動性、 7% NaCl、V-P試驗、明膠水解、吲哚試驗、硝酸鹽還原、硫化氫試驗和過氧化氫試驗進行鑒定。

芽孢桿菌鑒定：通過氧化酶、葡萄糖發酵、V-P試驗、脲酶酶反應、甘露醇利用、明膠水解、硝酸鹽還原和pH5.7 生長試驗進行鑒定。

1. 2.4 16SrRNA序列分析

將分離得到的優勢微生物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序得到的結果于NCBI數據庫進行BLAST（basic local alignment search tool，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性比對分析。

1.2.5 醪糟分離菌耐受性研究

1.2.5.1對溫度的耐受性研究

將活化好的醪糟分離菌接種于牛肉膏蛋白脈培養基中，分別置于32，37，42，47，65℃培養 ^48h ，觀察生長情況。每組設置3個平行。

1.2.5.2 對鹽濃度的耐受性研究

將活化好的分離菌接種于NaCl濃度為 2%.5% 、7%.10% 的牛肉膏蛋白脈培養基中， 37^°C 培養 ^48h 觀察分離菌的生長情況。每組設置3個平行。

1.2.6 醪糟分離菌產酶特性研究

產淀粉酶試驗[13-14]：將 15mL 可溶性淀粉培養基注入直徑為 90cm 的無菌培養皿中，待凝固成平板后，挑取單菌落點接于平板上，于 培養 ^48h 后，將碘液滴加在平板上，觀察菌落周圍是否出現透明圈，若出現透明圈，說明該菌株能夠產淀粉酶，具有分解淀粉的能力。用直尺分別測量透明圈直徑和菌落直徑的大小并記錄，取平均值，以HC為指標，通過比較HC的大小進行篩選，其中 HC= 透明圈直徑/菌落直徑。

產脂肪酶、蛋白酶試驗[13]：挑取單菌落點接于鑒別培養基平板上，置于 的培養箱中培養，觀察培養基菌落周圍是否出現明顯的透明圈，如有明顯的透明圈出現，說明該菌株能夠產蛋白酶或脂肪酶，具有分解脂類、蛋白質大分子的能力。觀察透明圈，用直尺分別測量透明圈直徑和菌落直徑并記錄，取平均值，以HC為指標，通過比較HC的大小進行篩選，其中 HC= 透明圈直徑/菌落直徑。

1.3 數據統計分析

采用Excel對數據進行處理，采用SPSS25.0分析軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1醪糟中微生物的鑒定

2.1.1醪糟乳酸菌的鑒定

表1乳酸菌形態鑒定結果

注：“ + ”代表陽性反應，“一”代表陰性反應，表4同。

采用平板計數法對牧區醪糟分離得到的優勢乳酸菌進行分離、純化。由表1和表2可知，牧區醪糟中分離得到3株優勢乳酸菌。根據表1和表2中乳酸菌形態學和生理生化鑒定的結果，查詢《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》和《常見細菌系統鑒定手冊》并結合16SrRNA序列測序的同源性比對結果可知LZ1#、LZ2#、LZ5#為乳酪短桿菌。

2.1.2 醪糟中芽孢桿菌的鑒定

采用平板計數法對燕麥醪糟中分離得到的芽孢桿菌進行分離、純化。最終在牧區醪糟中得到3株優勢芽孢桿菌。3株芽孢桿菌的形態學結果和生理生化鑒定結果見表3和表4。

根據芽孢桿菌形態學結果、生理生化鑒定結果，查詢《伯杰氏細菌鑒定手冊》結合 序列測序的同源性比對結果可知LZ3#、LZ4#、LZ6#均為枯草芽孢桿菌。

2.2 醪糟分離菌耐熱性

耐高溫菌指在高于 45°C 的環境中能夠生長和繁殖的微生物，其耐熱嗜熱、降解性能好、代謝效率高，在多領域發揮著重要作用。不同溫度下醪糟分離菌的生長情況見表5。

表5不同溫度下醪糟分離菌的生長情況

由表5可知，6株醪糟分離菌在 47，65^°C 下均能生長，具有較好的耐熱性能；隨著培養溫度的升高，LZ1#、LZ2#、LZ4#、LZ5＃、LZ6＃菌落總數呈現下降趨勢；LZ3#菌落總數呈現先升高后降低的趨勢；LZ4#在32，37，42，47℃下的菌落總數遠高于其他菌株。

2.3 醪糟分離菌耐鹽性

表6不同鹽分下醪糟分離菌的生長情況

Table6Growthofbacteria isolated fromfermented glutinous riceat different salt content

注：“一\"表示不生長。

由表6可知，6株醪糟分離菌在不同鹽含量下的生長情況不同， LZ1#，LZ2#，LZ5# 僅在鹽含量為2% 時生長，LZ3#、LZ4#、LZ6#在鹽含量達 10% 時還能生長，這3株醪糟分離菌具有較好的耐鹽性能； LZ6# 在不同鹽分下的菌落總數均高于其他菌株，其具有更好的耐鹽特性，可作為耐鹽發酵食品的發酵劑進行開發[15]。

2.4醪糟分離菌的產酶特性

表7醪糟分離菌的產酶特性

注：“一\"表示不產相應酶；同列不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05） 。

由表7可知，LZ1#、LZ3#、LZ5#能夠產淀粉酶，具有水解淀粉的能力，LZ3#、LZ5#產淀粉酶的能力顯著高于LZ1#（ Plt;0.05） ；由于淀粉液化過程對淀粉酶的熱穩定性要求極高，所以淀粉深加工的細菌源淀粉酶多數來自枯草芽孢桿菌，因此，結合LZ5#的耐熱性，其可作為細菌源淀粉酶的菌株，微生物源淀粉酶廣泛應用于食品、淀粉改性等領域[16]。6株醪糟分離菌均能夠產蛋白酶、脂肪酶。 LZ3?，LZ6 #產蛋白酶的能力顯著高于其余菌株（ Plt;0.05） 。LZ1#產脂肪酶的能力最強，且顯著高于其余菌株（ （Plt;0.05） 。與動植物源酶比較，微生物源酶類培養簡便且易批量生產，具有成本低、效益高的優勢，因此，6株醪糟分離菌依據其產酶特性可作為微生物源酶的產生菌。

3結論

本研究以牧區醪糟為微生物來源，進行微生物的分離、純化、鑒定。從牧區醪糟中分離得到6株菌株，經生理生化鑒定和16SrRNA分子生物學鑒定，LZ1#、LZ2#，LZ5 #為乳酪短桿菌， LZ3#，LZ4#，LZ6# 為枯草芽孢桿菌。利用菌落計數法觀察6株菌在不同鹽環境下和不同培養溫度下的生長情況，發現 LZ3?，LZ4? 、LZ6#具有很強的耐鹽性，在 10% 的鹽環境下仍能夠保持生長；6株菌均能在 65^°C 下生長，具有耐熱性， LZ4? 的耐熱性更強。6株菌均能夠產蛋白酶、脂肪酶，能夠分解蛋白質和脂類。LZ1#、LZ3#、LZ5#能夠產淀粉酶，具有水解淀粉的能力。因此，醪糟分離菌（LZ1#、LZ3?、LZ5?） 具有良好的耐熱性且其具有產淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的能力，3株醪糟分離菌有望開發成牧區醪糟專用發酵菌劑和酶制劑，為提高牧區醪糟純種發酵、品質調控、產品開發提供菌種資源保障。

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