幾株分離自麻天牛的白僵菌的生長、產孢特性及產酶能力分析

摘要

昆蟲病原真菌白僵菌Beauveria spp.是害蟲生防產品研發的主要真菌之一，其生長及產酶特性是高毒力菌株篩選的重要依據。本研究對15株分離自麻天牛僵蟲的白僵菌進行了鑒定，并對其生長、產孢以及胞外水解酶活性進行了測定分析。rDNAITS序列進化關系分析結果顯示，15株白僵菌中11株為球孢白僵菌B.bassiana，4株為硫酸白僵菌B.sulfurescens。不同溫度及培養基條件下菌株生長與產孢分析結果表明，25℃，PPDA培養基適合大部分白僵菌的生長，溫度下降至20℃時各菌株產孢量更高;CN004、CN011、CN012及CN055菌株為產孢優勢候選菌株，其中CN055菌株產孢量可達到（1.99±0.57）×106 個/mm2。胞外水解酶活性測定結果表明，CN006、CN012、CN040及CN055的幾丁質酶活性較強，且幾丁質酶活性呈現先上升后下降趨勢，培養至第5天酶活性最高。CN009、CN019、CN040及CN055菌株的蛋白酶活性較強，蛋白酶活性呈現先急劇上升、再平緩上升的趨勢，CN055菌株第9 天的酶活性為（472.5±0.39） U/mL，顯著高于其他菌株（Plt;0.05）。CN040和CN055菌株在產孢、產幾丁質酶和蛋白酶能力上兼具優勢，可作為后續研發的重點菌株。

關鍵詞

白僵菌; 產孢; 幾丁質酶; 蛋白酶; 篩選

中圖分類號：

S 476.12

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024523

Characteristics of growth， sporulation and enzyme production capacity of Beauveria strains isolated from Thyestilla gebleri

CAI Ni1#， QIAO Zhijun1，2#， LIU Fang1， FANG Wei1， LIU Shaofang3， NONG Xiangqun4， WANG Kaimei1*

（1. Hubei Biopesticide Engineering Research Centre， Wuhan 430064， China; 2. School of Life Science and Technology，

Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430030， China; 3. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Natural Microbial

Medicine Research， Nanchang 330013， China; 4. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect

Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

The entomopathogenic fungus Beauveria spp. is one of the most important fungal genera for the development of biocontrol agents. Growth and enzyme production traits are key indicators for selecting highvirulence strains. In this study， 15 Beauveria strains were isolated from naturally infected Thyestilla gebleri and identified via rDNAITS sequence analysis. Among them， 11 strains were identified as B. bassiana， and four as B.sulfurescens. The effects of temperature and media on fungal growth and sporulation were evaluated. Most strains exhibited optimal growth at 25℃ on PPDA medium， while sporulation peaked at 20℃. Strains CN004， CN011， CN012 and CN055 exhibited superior sporulation， with CN055 producing up to （1.99±0.57）×106 conidia/mm2. Extracellular enzyme activity assays showed that CN006， CN012， CN040 and CN055 had strong chitinase activity， which peaked on the 5th day after inoculation before declining. CN009， CN019， CN040 and CN055 showed high protease activity， with a sharp initial increase followed by a slower rise. On the 9th day， CN055 displayed the highest protease activity （472.5±0.39 U/mL）， significantly higher than other strains （Plt;0.05）. In summary， CN040 and CN055 demonstrated superior traits in terms of sporulation and hydrolytic enzyme production， making them promising candidates for future development of fungal biopesticides.

Key words

Beauveria spp.; sporulation; chitinase; protease; strain selection

白僵菌 Beauveria spp.是重要的昆蟲病原真菌，其生態友好，致病力強，對人畜、作物無毒，在農業、林業和醫學等領域有重要應用價值，尤其在生物防治中表現突出。白僵菌屬真菌已報道的有20 多個種［1］，其中以球孢白僵菌Beauveria bassiana與布氏白僵菌B.brongniartii昆蟲致病性研究最多。例如，張瀚文等［2］用 1×108 個/mL 球孢白僵菌孢子懸浮液分別侵染長林小蠹Hylurgus ligniperda幼蟲和成蟲，接種后7 d，長林小蠹幼蟲和成蟲的校正死亡率均達到 100%;林華峰等［3］用布氏白僵菌處理斜紋夜蛾Spodoptera litura 2齡幼蟲，其致死中時（LT50）為2.95 d，累計校正死亡率達到100%。另外的一些種的代謝產物具有昆蟲毒性或藥用活性。例如硫酸白僵菌B.sulfurescens的代謝產物中有一種N寡甘露糖型糖鏈的糖蛋白，將其注射到大蠟螟Galleria mellonella幼蟲體內會使昆蟲表皮變黑，LD50小于10 μg/kg［4］;丁曉娟等［5］對多株昆蟲病原真菌代謝物進行了單胺氧化酶（MAO）活性測定，發現多形白僵菌B.amorpha菌株Ba02代謝物具有很強的抑制MAO的活性，具有潛在藥物開發價值。而球孢白僵菌在白僵菌屬中殺蟲譜最廣，能侵染15目149科700 多種昆蟲［6］，因此，目前生防真菌產品的研究與開發仍以球孢白僵菌為主。

白僵菌主要以分生孢子侵染寄主，菌株的生長狀況以及分生孢子的產量是與殺蟲真菌生產直接相關的重要性狀，不同菌株的菌絲生長速率、產孢初始時間、產孢量、孢子萌發率及致病力存在差異［7］，在開發生防真菌產品時，需要結合菌株的生長特性進行篩選，其中產孢量和致病力高低是產品開發的重要篩選指標［8］。

毒力測定是評價高毒力菌株應用潛力的基礎。目前常采用生物測定法，但其過程繁瑣，且由于不同菌株的寄主范圍存在差異，篩選時容易遺漏有潛在致病能力的菌株，因此諸多學者在尋求某種補充指標，例如酶活力指標來輔助篩選［910］，以比較快捷的方式進行初篩以獲得高毒力菌株。白僵菌對昆蟲寄主的侵染和致病過程一般要經歷幾個階段，即分生孢子附著、萌發、體壁穿透，菌絲在血腔內生長，營養攝取，毒素釋放，最終破壞寄主組織，使昆蟲罹病死亡［11］。穿透昆蟲體壁是昆蟲病原真菌成功感染寄主的關鍵，此過程涉及特殊侵染結構（附著胞）的形成和機械力的產生以及表皮降解酶（幾丁質酶、蛋白酶、脂肪酶等）的作用［12］。

蛋白質、幾丁質和脂類等是昆蟲體壁的主要組成物質，St Leger等［13］在1987年以昆蟲體壁為培養基離體培養金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae，首次發現了昆蟲病原真菌蛋白酶的結構特性，隨后的研究表明病原真菌的幾丁質酶和蛋白酶與其要入侵的昆蟲表皮存在聯系［14］，并且在真菌孢子萌發、入侵寄主和完成侵染的過程中發揮一定作用，認為其與菌株的毒力發揮有關［1516］。尤其是其分泌的胞外蛋白酶在侵染宿主過程中降解宿主表皮成分，激活宿主體內血淋巴酚原氧化酶超量表達，導致宿主因中毒而死亡［17］。馮明光［18］以血黑蝗Melanoplus sanguinipes為試蟲測定了17 株不同來源球孢白僵菌的胞外蛋白酶活性及其毒力，發現各菌株胞外蛋白酶活性與其毒力顯著正相關。殷紅福等［19］測定了球孢白僵菌對松墨天牛Monochamus alternatus 4齡幼蟲的毒力，結果顯示其校正死亡率與幾丁質酶活性間呈直線正相關，且相關性極顯著。以上研究結果表明，利用菌株幾丁質酶以及蛋白酶的活性對白僵菌菌株進行初步的殺蟲活性篩選，是較為可靠的方式。

本研究從麻天牛僵蟲中分離得到了15株白僵菌，擬通過分子生物學鑒定確定其分類地位，結合生長、產孢能力分析以及幾丁質酶、蛋白酶活力測定，初步確定其應用潛力，為生防白僵菌產品的開發提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試15株白僵菌由本實驗室從武漢乙森生態科技有限公司提供的麻天牛Thyestilla gebleri 成蟲僵蟲上分離純化得到。

1.1.2 供試培養基

真菌純化培養基：麥芽糖 6.25 g/L，麥芽提取物 6.25 g/L，酵母提取物 1 g/L，蛋白胨 6.25 g/L，KH2PO4 1.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，pH 7.0。

真菌生長、產孢量測定使用培養基PPDA、SDAY、MEA，培養基的配制參考文獻［2021］，胞外蛋白酶和幾丁質酶產量測定使用干酪素瓊脂培養基（CaA）和殼聚糖培養基（CA），配制方法分別參考文獻［22］與［23］，蛋白酶誘導培養基和幾丁質酶誘導培養基的配制參考文獻［24］。

1.2 菌株的分離純化

在冷卻至 50～55℃的真菌純化培養基中加入終濃度為70 mg/L的多果定、125 mg/L頭孢霉素和138 mg/L硫酸卡那霉素，進行白僵菌的選擇性分離［25］。在無菌條件下，用無菌牙簽挑取僵蟲體表的菌絲，進行連續劃線，重復 3 個平板。28℃培養3～5 d，挑取單菌落至純化培養基上，純化3次后保存于PPDA斜面，4℃保存備用。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 基因組 DNA提取

將純化后的菌株接種于鋪有滅菌玻璃紙的PPDA固體培養基表面，28℃恒溫培養5～7 d，收集菌絲。采用真菌基因組DNA提取試劑盒［簡石生物技術（北京）有限公司］提取各菌株的基因組DNA。

1.3.2 ITS序列擴增及測序

以真菌基因組DNA為模板，以通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）對菌株rDNAITS 區域進行PCR擴增［26］。反應程序為：95℃預變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，共28個循環;72℃延伸 2 min。PCR產物送擎科生物技術有限公司測序，將擴增所得到的ITS序列在NCBI網站（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行BLAST相似性比對初步確定其種屬。

1.3.3 系統發育分析

將測得的序列與GenBank中下載的白僵菌ITS序列信息一起，用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件分別對基因序列進行比對分析并以fasta格式保存，用MEGA X軟件以鄰接法（neighborjoining，NJ）構建單基因系統進化樹，bootstrap值設為1 000。根據分析結果進行物種鑒定。

1.4 菌株生長與產孢性能測定

將純化的白僵菌產生的分生孢子用0.1%的吐溫80配成1.0×107個/mL的懸浮液。在PPDA、SDAY及MEA 平板中央放置直徑為5 mm的滅菌濾紙，用移液器分別點滴接種5 μL孢子懸浮液于濾紙上，晾干后分別于20、25℃及28℃恒溫箱中倒置培養，各重復3次。于接種后第7 天用電子數顯卡尺測量菌落直徑，按十字交叉法測量后取其平均值，通過計算生長直徑比較各白僵菌菌株的菌絲生長速率。同時用直徑 5 mm的打孔器在菌落上距離菌落中心1/2處打取菌餅，每菌落按十字對稱取4個菌餅，置于5 mL的0.1%吐溫80無菌水中，振蕩使孢子充分分散。用血球計數板測定孢子濃度并換算成單位面積（mm2）的產孢量，各菌株重復測定3 次。

1.5 不同白僵菌菌株幾丁質酶和蛋白酶活性測定

1.5.1 產幾丁質酶及蛋白酶的能力測定

白僵菌菌株的胞外蛋白酶和幾丁質酶產酶量測定參照何景超［27］的方法加以改進。將15株白僵菌的分生孢子用0.1%吐溫80配成1.0×108個/mL的孢子懸浮液，用移液槍吸取3 μL分別接種于CA和CaA平板中央，CA平板于28℃培養9 d后用 5% NaOH溶液鋪滿平板表面，CaA平板于28℃培養5 d后用 0.4 moL/L 三氯乙酸溶液鋪滿平板表面，觀察菌落的周圍是否出現清晰透明的環狀，產酶量以直徑比（直徑比=透明圈直徑/菌落直徑）來表示。每個菌株設置 3 個重復。

1.5.2 幾丁質酶誘導分泌活性測定

胞外幾丁質酶誘導與檢測參考文獻［24］：在 250 mL 的三角瓶中裝入 40 mL 滅菌的幾丁質酶誘導培養基，將1.0×108個/mL的白僵菌菌株的分生孢子按照2%比例（V/V）接入，（25±1）℃、180 r/min 于恒溫搖床中振蕩培養，每組 3 個重復。于誘導后的第5 天 取培養液于 4℃、6 000 r/min離心 10 min，上清液即為粗酶液。以 1%的膠體幾丁質為底物測量幾丁質酶活性，將粗酶液和 1%膠體幾丁質混合，放入 40℃ 水浴鍋中反應 1 h 后加入 DNS 試劑，沸水煮 5 min 后取出，待冷卻至室溫后用超純水定容至25 mL，在 540 nm 處測量吸光度，

每處理取3份樣品，分別

測定 3 次，取平均值計算幾丁質酶活性，每分鐘轉化生成 1 μg N乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量定義為 1 個酶活單位。

1.5.3 蛋白酶誘導分泌活性測定

胞外蛋白酶誘導與檢測參考文獻［28］：在 250 mL 的三角瓶中裝入 50 mL 滅菌的蛋白酶誘導培養基，參照1.5.2接種菌株孢子及誘導培養。于誘導后的第5 天 取培養液于 4℃、6 000 r/min 離心 10 min，上清液即為粗酶液。以 2%酪蛋白為底物測量蛋白酶活性，將粗酶液和 2%的酪蛋白混合，在40℃水浴鍋中反應10 min后取出，加入三氯乙酸終止反應，25℃、 12 000 r/min 離心 5 min 后取上清液，加入 2 mL 0.4 mol/L的 Na2CO3 和1 mL 福林酚試劑混勻后40℃顯色反應 20 min， 在 680 nm 處測量吸光度，每處理取3份樣品，分別測定3次吸光度取平均值，根據標準曲線計算蛋白酶活性，將每分鐘轉化生成 1 μg 的酪氨酸所需要的酶量定義為 1 個酶活單位。

1.5.4 候選菌株幾丁質酶和蛋白酶活性測定

通過比較各個白僵菌菌株的生長、產孢以及產酶能力，選取候選菌株對其胞外幾丁質酶（CN006，CN012，CN040，CN055）與蛋白酶（CN009，CN019，CN040，CN055）的活性進行進一步檢測。參照1.5.2和1.5.3，于誘導后第 1、3、5、7、9天分別取少量培養液制備粗酶液，測量其酶活并進行比較。

1.6 數據處理與分析

所有結果均以平均值±標準差（SD）表示，采用Oneway ANOVA 和Tukey’s honest significant difference （HSD） test檢驗（SPSS 26.0）進行差異顯著性分析（Plt;0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 白僵菌菌株的分子生物學鑒定

15個菌株的rDNAITS序列長度約為 570 bp。將序列與 GenBank 中的核酸序列進行比對，其中有11個菌株與球孢白僵菌Beauveria bassiana的相似性高于99%，4株白僵菌菌株（CN002、CN003、CN009和CN043）與硫酸白僵菌B.sulfurescens的相似性高于99%。從 GenBank下載親緣關系較近的 ITS 序列，以淡紫擬青霉Purpureocillium lilacinum （NR165946.1）為外群，利用 MEGA X軟件，采用鄰接法構建系統發育樹（圖 1）。結果顯示，所有白僵菌菌株與淡紫擬青霉聚類在不同分支，其中11個菌株與球孢白僵菌 B.bassiana 聚為一類;CN002、CN003、CN009和CN043與硫酸白僵菌B.sulfurescens （PP384656.1）聚為一類，并與白僵菌屬的其他菌株形成明顯分支。因此將分離菌株中的11 個菌株初步鑒定為球孢白僵菌，將CN002、CN003、CN009和CN043初步鑒定為硫酸白僵菌。

2.2 白僵菌菌株的生長特性與產孢能力

2.2.1 15株白僵菌在不同溫度不同培養基上的生長特性

為評估不同白僵菌菌株生長特性，將 15 株白僵菌菌株孢子懸浮液分別點接在 PPDA、SDAY和MEA 培養基中心，于20、25、28℃恒溫培養 7 d，15株白僵菌在不同培養基上的生長量不同，菌落平均生長直徑以在PPDA上最大（表1）;在同一培養基及不同溫度下，菌株在25℃生長最好，菌落平均生長直徑最大。因此，PPDA培養基及25℃培養適合大部分白僵菌菌株的生長。

比較不同菌株在不同溫度和培養基上的生長量，結果顯示，CN003、CN005、CN015、CN019及CN033菌株的生長量在不同培養基上較其他菌株更有優勢。20、25℃及28℃下這5個菌株在PPDA培養基上的生長量高于其他菌株，且在SDAY，MEA上的生長量也較高。其中CN003菌株25℃下PPDA培養基上的生長量最高，為（40.22±0.67） mm，顯著高于20、28℃下在該菌株在PPDA上的生長量（Plt;0.05），但與25℃下PPDA培養基上CN005、CN015、CN019及CN033（菌落直徑gt;39 mm）菌株的生長直徑無顯著差異。

2.2.2 白僵菌菌株在不同溫度及不同培養基上的產孢量

20、25℃及28℃下，供試的15 株白僵菌在PPDA、SDAY和MEA 培養基上的產孢量測定結果表明，在同一溫度下，不同培養基上15株白僵菌的平均產孢量總體上表現出PPDAgt;SDAYgt;MEA（表2）。在PPDA和MEA培養基上，菌株在不同溫度下的產孢量表現出20℃gt;28℃gt;25℃;其中在20℃的PPDA和MEA平板上，15株白僵菌的平均產孢量分別為8.8×105 個/mm2和1.5×105 個/mm2。但在SDAY培養基上，菌株在不同溫度下的產孢量表現出25℃gt;20℃gt;28℃，25℃下15株白僵菌的平均產孢量為2.4×105個/mm2。

CN004、CN011、CN012及CN055菌株在不同溫度下的PPDA培養基上產孢量顯著高于其他菌株，其中CN055菌株在28℃下PPDA平板上產孢量最高，為（1.99±0.57）×106 個/mm2， 顯著高于同溫度下（28℃）其他菌株的產孢量（Plt;0.05）。但CN004、CN011和CN012菌株在20℃下的產孢量較25℃、28℃更優。因此總體上看，在20℃培養條件下，PPDA培養基適合大部分白僵菌產孢。

2.3 白僵菌菌株產幾丁質酶和蛋白酶的能力及誘導分泌活性

不同菌株在 CA 培養基上培養 9 d 后，采用 5% NaOH 溶液處理 CA 平板后均出現明顯的透明圈，這表明所有的白僵菌菌株均具有產生幾丁質酶的能力。透明圈直徑比較大的菌株分別為CN006gt;CN004gt;CN012gt;CN011gt;CN055gt;CN040（圖2a），其中CN006菌株的平均透明圈直徑為（34.28±0.3）mm，直徑比最大（1.48±0.01），顯著高于其他菌株（Plt;0.05）（表3）。在對誘導培養第5 天各個菌株胞外幾丁質酶活性進行檢測后發現，胞外幾丁質酶活力較高的菌株分別為CN009gt;CN055gt;CN006gt;CN040gt;CN012，酶活力均大于18 U/mL，其中CN009菌株的胞外幾丁質酶活力最高，為（23.37±0.66） U/mL，顯著高于其他菌株（Plt;0.05）。并且CN006、CN012、CN040和CN055菌株透明圈的直徑比與胞外幾丁質酶活力均位于前五位，表現出一致性。

不同菌株在CaA培養基上培養5 d后，采用三氯乙酸溶液處理CaA平板后均出現明顯的透明圈，且各個菌株透明圈的直徑比均高于1.9（表4），這表明15株白僵菌菌株均具有產蛋白酶能力。透明圈直徑比較大的菌株分別為CN009gt;CN040gt;CN055gt;CN004gt;CN011gt;CN019（圖2b），其中CN009菌株的平均透明圈直徑為（33.56±0.17）mm，直徑比最大（2.34±0.01），顯著高于其他菌株（Plt;0.05）（表4）。在對誘導培養后第5 天各個菌株胞外蛋白酶活性進行檢測后發現，各菌株蛋白酶活性均高于108 U/mL，胞外蛋白酶活性較高的菌株分別為CN055gt;CN002gt;CN009gt;CN040gt;CN019，其中CN055菌株的蛋白酶活性最高，為（249.41±1.35） U/mL，顯著高于其他菌株（Plt;0.05）。并且CN009、CN019、CN040及CN055菌株透明圈的直徑比與蛋白酶活性均較高，表現出一致性。

2.4 候選菌株幾丁質酶和胞外蛋白酶產生動態

對透明圈直徑比與胞外酶活力表現出一致性的菌株進一步進行胞外酶活性測定，結果顯示，各菌株幾丁質酶和蛋白酶的產酶趨勢在整個生長期基本一致。其中幾丁質酶的產量在生長1～3 d無顯著上升，第5天達到最高，隨后下降。CN055菌株的幾丁質酶活力最高可達到（21.26±0.79） U/mL，顯著高于CN006、 CN012和CN040菌株（Plt;0.05）（表5）。各菌株蛋白酶的產量在第3天大幅上升，5～7 d進入一個平緩期，第9天產酶量達到最高，其中第9天，CN055菌株的產蛋白酶酶活最高，為（472.5±0.39） U/mL，顯著高于CN009、 CN019和CN040菌株（Plt;0.05）（表6）。

3 結論與討論

白僵菌是昆蟲病原真菌的典型代表之一，已開發成多種生防真菌產品用于防治農林害蟲。昆蟲病原真菌菌株的生長特性、初始產孢時間和產孢量以及對靶標害蟲的毒力高低是判斷其生物防治潛力以及能否進行商業化生產的關鍵。依據菌落形態特征、生長速率、產孢量和蛋白酶等生物學特性可對高活性昆蟲病原真菌菌株開展初步篩選［2930］。

溫度和營養成分是影響白僵菌生長和產孢的重要因素。前人曾報道大多數真菌生長的最適溫度范圍為 20～30℃［31］，此外培養基碳源和氮源含量與白僵菌生物學特性密切相關［32］。林華峰等［33］研究發現布氏白僵菌B.brongniartii和金龜子綠僵菌Metrzhizium anisopliae的最適宜培養基為 PPDA。王定鋒等［20］發現白僵菌菌株 Bbr1552 生長速率和產孢量也在PPDA上最高，且菌株 Bbr1552 的最適生長和產孢溫度均為 25℃。在對布氏白僵菌MM1菌株培養條件優化中也同樣發現，15℃下菌株產孢量較20、25℃更高［34］。本研究結果表明，相較于營養較為豐富的SDAY培養基和MEA培養基， PPDA 培養基更適合從天牛僵蟲分離的白僵菌菌株的生長和產孢。此外，本研究中供試的15株白僵菌菌株在25℃培養條件下的平均生長直徑普遍優于20℃和28℃培養條件下的生長直徑，但在20℃下各菌株的平均產孢量（8.8×105 孢子/mm2）較25℃及28℃培養條件下更優，其原因可能是一定的低溫脅迫有利于菌株生殖生長，但更低溫度是否更有利于從天牛僵蟲分離的白僵菌菌株的產孢還需進一步探討。

魏靈燕等［35］對15株白僵菌菌株的培養特性（孢子萌發率、產孢量和菌落生長速率）進行相關分析時發現，菌株的產孢量與菌落生長速率無顯著相關性。本研究在比較不同溫度及培養基下各個菌株的生長與產孢量時發現，同一溫度同一培養基上生長與產孢較為優勢的菌株也并不一致，其中生長能力較為突出的菌株為CN003、CN005、 CN015、CN019和CN033，而產孢能力較為突出的菌株為CN004、CN011、CN012和CN055。由此可推測菌株的生長量與產孢量并不直接關聯。

幾丁質酶與蛋白酶能夠協助真菌穿透宿主的角質層感染宿主［15］。有研究報道，幾丁質酶在白僵菌侵染家蠶的過程中起重要作用，而蛋白酶是白僵菌導致家蠶死亡的主要因素［36］。林志偉等發現球孢白僵菌Bz4菌株在膠體幾丁質液體中培養5～6 d時菌株幾丁質酶活性達到最大［37］。王露露等比較了菌株 SQJC1，SDJC3 和 GXHC1在培養2、4、5、6、8 d時胞外蛋白酶的活性，結果顯示SQJC1菌株胞外蛋白酶含量在第 5 天達到最高，表現出先升高后降低的趨勢［38］，本研究通過平板透明圈法分析了15株白僵菌菌株的產酶能力，結果顯示，菌株 CN006、CN012、CN040及CN055的透明圈直徑比與幾丁質酶活性表現出一致性，均高于其他菌株。菌株CN009、CN019、CN040和CN055的透明圈直徑比與蛋白酶活性較高，也表現出一致性。分別測定誘導后1、3、5、7、9 d這兩組菌株幾丁質酶以及蛋白酶活性發現，幾丁質酶在培養第5天即達到最高，隨后下降，這與林志偉等［37］測定球孢白僵菌Bz4菌株在膠體幾丁質液體中產酶量的結果基本一致。本研究中蛋白酶活性則表現出“升高——平緩——升高”的趨勢，培養第9 天時4株白僵菌菌株的酶活性均高于200 U/mL，其中CN055菌株的酶活性達到（472.5±0.39） U/mL，這一趨勢與他人的研究結果存在一定差異，具體原因還需進一步探討。

昆蟲病原真菌胞外酶活性與菌株毒力的關系一直被廣為探討。近年來，采用超量表達、基因敲除等基因工程方法已證實昆蟲病原真菌產生的胞外酶可以作為毒力因子。在球孢白僵菌中過表達幾丁質酶基因（Bbchit1）可增強白僵菌對桃蚜Myzus persicae的毒力［39］，在白僵菌中轉入胞外水解酶，蛋白酶和幾丁質酶融合基因（CDEP1：Bbchit1）后，通過蛋白酶和幾丁質酶的交互協同作用，工程菌株對桃蚜的致死中時間降低了23%，菌株毒力顯著提高［40］。但胞外水解酶活性與菌株毒力的相關性還不確定。胡錦江等發現，隨著菌株繼代次數的增加，產胞外蛋白酶水平降低，且對馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus的毒力也隨之減弱［41］，進一步研究發現，胞外蛋白酶活性與其毒力具有正相關關系［42］;而在以亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis為試蟲探討胞外蛋白酶活性與累積死亡率相關性時，R2僅為0.224，酶活性和累積死亡率只具有簡單的趨勢關系，并無直接相關性［43］。這些差異性結果可能是由于胞外蛋白酶和胞外幾丁質酶為誘導性酶，主要作用于病菌穿透寄主體壁的過程，在利用液體培養測定酶活時，缺失寄主誘導因子，可能會出現酶活與實際毒力水平不一致的情況。故本研究測定胞外蛋白酶活性及幾丁質酶活性也僅作為白僵菌毒力的補充篩選指標，后續還將結合生物測定進一步確定候選菌株。

綜上所述，通過對從天牛僵蟲中分離的15株白僵菌生長特性及產酶能力測定，確定白僵菌最適生長和產孢培養基為 PPDA 培養基，在PPDA培養基中的最適產孢溫度為20℃。CN006、CN012、CN040及CN055菌株具有較高的產幾丁質酶能力，CN009、CN019、CN040及CN055菌株產蛋白酶能力較為突出，并且CN040和CN055菌株在產孢、產幾丁質酶及蛋白酶能力上兼具優勢，在進一步研發中值得重點關注。

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（責任編輯：楊明麗）