尖尾芋石油醚部位化學成分及其乳腺癌細胞毒活性研究

王 鵬,陳 婭,彭蘭淳,鄭青竹,彭江麗,2,彭求賢,3*

1湖南中醫(yī)藥大學藥學院;2湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心;3湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室,長沙410208

天南星科海芋屬植物尖尾芋Alocasiacucullata(Lour.)Schott 以其干燥根莖入藥,最早記載于《廣西實用中草藥新選》,其味辛、微苦,性寒,有毒,歸肺經(jīng),具有清熱解毒,消腫鎮(zhèn)痛的功效[1,2]。尖尾芋根莖在民間多用于高熱不退、流感、鉤端螺旋體病、腸傷寒、瘰疬以及肺結(jié)核;外用治療疔瘡、燙火傷、毒蛇咬傷和毒蜂蜇傷[2]。尖尾芋有毒,需久煎6 h以上方可內(nèi)服,誤食尖尾芋時,民間用醋加生姜汁少許共煮,內(nèi)服或含漱以解毒,臨床上通過肌注苯海拉明及靜注葡萄糖鹽水以解毒[3]。現(xiàn)代研究表明尖尾芋水提物、醇提物具有顯著的藥理活性,如抗炎[4]、抗腫瘤[5-8]及脾保護作用[9]等,但尖尾芋的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究比較薄弱,特別是其石油醚部位化學成分研究僅局限于GC-MS分析。因此,本文以尖尾芋石油醚部位為研究對象,采用硅膠、Sephadex LH-20等色譜方法進行分離純化,并采用紫外光譜、一維核磁共振譜等各種波譜學技術(shù)鑒定尖尾芋石油醚部位化學成分,探究其石油醚部位藥效物質(zhì)基礎(chǔ),同時以人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞及小鼠乳腺癌4T1細胞為篩選模型,對分離得到的單體化合物進行乳腺癌細胞毒活性研究。以期為尖尾芋的深入研究和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

INOVA-600MHz核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);HR-ESI-TOF-MS光譜儀(美國Agilent公司);TC-20全自動細胞計數(shù)儀(美國Bio-rad公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠填料(瑞典GE Healthcare公司);GF254薄層色譜硅膠(青島海洋化工廠分廠);石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醇及甲醇等試劑均為分析純(湖南匯虹試劑有限公司);陽性對照品順鉑(批號:115583,MedChemexpress公司);二甲基亞砜(99%生物技術(shù)級)(批號:C14637730,上海麥克林生化科技有限公司);CCK-8試劑盒(批號:AK13974,武漢伊萊瑞特生物科技有限公司);DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS磷酸緩沖液、0.25%胰蛋白酶溶液、胎牛血清(批號:WHB823G111、WH0021G221、WHAB23Z251、SA211028,武漢普諾賽生命科技有限公司)。人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、小鼠乳腺癌細胞4T1(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

尖尾芋于2021年11月購于廣西欽州,由湖南中醫(yī)藥大學劉塔斯鑒定為尖尾芋Alocasiacucullata(Lour.) Schott,憑證標本(2021113)保存于湖南中醫(yī)藥大學湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取與分離

本實驗稱取尖尾芋根莖50 kg,粉碎,分為兩份,每份各24.58 kg。70%乙醇回流提取3次,每次2 h,減壓濃縮后得到密度為1.37的浸膏8.65 kg。浸膏經(jīng)蒸餾水混懸后,使用石油醚萃取20次,每次2 L,最終得到石油醚部位浸膏233.0 g。

稱取101.5 g尖尾芋石油醚部位浸膏,干法上樣于100～200目硅膠柱進行粗分(石油醚-乙酸乙酯,50∶1→30∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1;乙酸乙酯;甲醇)。將所收集部分經(jīng)薄層色譜分析后合并同類后得到9個組分,分為9段(Fr.1～Fr.9),每段粗分后均先以300～400目硅膠柱細分,再通過凝膠柱純化(填料為Sephadex LH-20),除Fr.9的洗脫體系為氯仿-甲醇(1∶1)外,其余組分的洗脫體系均為石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)。Fr.1(3.7 g)經(jīng)細分(石油醚-乙酸乙酯,50∶1)和純化后得到化合物7(15.3 mg)。Fr.2(4.2 g)經(jīng)細分(石油醚-乙酸乙酯,50∶1)和純化后得到化合物6(7.4 mg)。Fr.5(3.6 g)經(jīng)細分(石油醚-乙酸乙酯,10∶1→5∶1→1∶1)后得到化合物3(8.3 mg)。Fr.6(6.9 g)經(jīng)細分(石油醚-乙酸乙酯,10∶1)和純化后得到化合物8(8.6 mg)和9(6.4 mg)。Fr.7(5.2 g)經(jīng)細分(石油醚-乙酸乙酯,5∶1)和純化后得到化合物2(14.3 mg)。Fr.8(7.2 g)經(jīng)細分(石油醚-丙酮,10∶1)后得到化合物1(10.4 mg)。Fr.9(30.8 g)經(jīng)細分(石油醚-乙酸乙酯,3∶1)后得到化合物10(6.4 mg)和11(4.1 mg);經(jīng)細分(石油醚-乙酸乙酯,1∶1)和純化后得到化合物4(10.1 mg)和5(9.6 mg);經(jīng)細分(石油醚-丙酮,3∶1→1∶1)后得到化合物12(5.7 mg)、13(4.5 mg)和14(4.8 mg);經(jīng)細分(氯仿-甲醇,3∶1)后得到化合物15(6.7 mg)。

1.2.2 細胞毒性實驗

采用CCK-8法測試化合物1～15對人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7及小鼠乳腺癌細胞4T1的增殖抑制作用[10]。將處于對數(shù)生長期的3種乳腺癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成密度為1×106個/mL的單細胞混懸液,按照每孔100 μL接種于96孔板中,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h,再將15個化合物依次用DMSO溶解后,加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成6種不同濃度(3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的劑量組,以順鉑作為陽性對照藥物[11],設(shè)置5個復孔,孵育24 h后移棄上層培養(yǎng)液,每孔加入100 μL 0.1% CCK-8進行染色,孵育2 h后在酶標儀OD 450 nm測量各孔的吸光值(A),重復三次,計算IC50。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色針晶(CHCl3);ESI-MS:m/z145.2[M+Na]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.82(2H,d,J= 8.7 Hz,H-2,H-6),6.98(2H,d,J= 8.6 Hz,H-3,H-5);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:130.0(C-1),132.7(C-2,C-6),116.2(C-3,C-5),161.7(C-4),191.4(C-7)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[12]鑒定該化合物為對羥基苯甲醛。

化合物2白色針晶(CHCl3);ESI-MS:m/z123.0[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.14(2H,d,J= 7.0 Hz,H-2,H-6),7.49(2H,t,J= 7.9 Hz,H-3,H-5);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:129.5(C-1),130.4(C-2,C-6),128.6(C-3,C-5),134.0(C-4),172.5(C-7)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[13]鑒定該化合物為苯甲酸。

化合物3白色粉末狀固體;ESI-MS:m/z197.0[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.65(1H,dd,J= 8.3,1.9 Hz,H-6),7.55(1H,d,J= 2.0 Hz,H-2),6.93(1H,d,J= 8.3 Hz,H-5),5.99(1H,s,H-4),4.35(2H,q,J= 7.1 Hz,H-8),3.95(3H,s,H-10),1.38(3H,t,J= 7.1 Hz,H-9);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:124.3(C-1),111.8(C-2),146.3(C-3),150.0(C-4),114.1(C-5),122.8(C-6),166.6(C-7),60.9(C-8),14.5(C-9),56.3(C-10)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[14]鑒定該化合物為香草酸乙酯。

化合物4無色針晶(CHCl3);ESI-MS:m/z199.0[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.08(2H,s,H-2,H-6),1.37(3H,t,J= 7.1 Hz,H-9);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:121.6(C-1),109.9(C-2,C-6),146.2(C-3,C-5),139.5(C-4),168.5(C-7),61.5(C-8),14.6(C-9)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[15]鑒定該化合物為沒食子酸乙酯。

化合物5淡黃色粉末;ESI-MS:m/z184.7[M+Na]+。1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.79(1H,dd,J= 8.5,2.3 Hz,H-6),6.71(1H,d,J= 2.4 Hz,H-8),6.18(1H,d,J= 9.4 Hz,H-3);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:163.2(C-2),112.3(C-3),146.1(C-4),130.7(C-5),114.5(C-6),163.7(C-7),103.4(C-8),157.3(C-9),113.1(C-10)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[16]鑒定該化合物為7-羥基香豆素。

化合物6淡黃色油狀物;ESI-MS:m/z243.2[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:3.66(3H,s,H-15),2.29(2H,t,J= 7.6 Hz,H-2),1.61(2H,p,J= 7.5 Hz,H-13),1.30～1.23(20H,m,H-3,H-4,H-5,H-6,H-7,H-8,H-9,H-10,H-11,H-12);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:174.5(C-1),34.3(C-2),25.1(C-3),29.8(C-4,C-5,C-6,C-7,C-8,C-9,C-10,C-11),32.1(C-12),22.8(C-13),14.3(C-14),51.6(C-15)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[17]鑒定該化合物為肉豆蔻酸甲酯。

化合物7淡黃色油狀物;ESI-MS:m/z411.2[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.17～5.09(6H,m,H-3,H-7,H-11,H-14,H-18,H-22),2.09(8H,td,J= 9.5,5.0 Hz,H-5,H-9,H-16,H-20),2.08～1.97(12H,m,H-4,H-8,H-12,H-13,H-17,H-21),1.69～1.68(6H,m,H-1,H-25),1.61～1.60(18H,m,H-24,H-26,H-27,H-28,H-29,H-30);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:25.8(C-1,C-25),131.4(C-2,C-23),124.6(C-3,C-22),26.9(C-4,C-21),39.9(C-5,C-9),135.0(C-6,C-19),124.5(C-7,C-11),26.8(C-8,C-17),135.3(C-10,C-15),28.4(C-12,C-13),124.4(C-14,C-18),39.9(C-16,C-20),17.8(C-24,C-26),16.2(C-27,C-28),16.1(C-29,C-30)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[18]鑒定該化合物為角鯊烯。

化合物8白色粉末狀固體;ESI-MS:m/z457.4[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.28(1H,t,J= 3.7 Hz,H-12),1.17～1.12(3H,s,H-27),1.00～0.94(3H,s,H-23),0.77(3H,s,H-24);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:38.5(C-1),27.3(C-2),79.2(C-3),38.9(C-4),55.3(C-5),18.4(C-6),32.7(C-7),39.4(C-8),47.8(C-9),37.2(C-10),23.1(C-11),122.8(C-12),143.7(C-13),41.7(C-14),27.8(C-15),23.7(C-16),46.7(C-17),41.1(C-18),46.0(C-19),30.8(C-20),33.9(C-21),32.6(C-22),28.2(C-23),15.7(C-24),15.5(C-25),17.3(C-26),26.1(C-27),183.4(C-28),33.2(C-29),23.5(C-30)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[19]鑒定該化合物為齊墩果酸。

化合物9白色粉末狀固體;ESI-MS:m/z457.4[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.23(1H,t,J= 3.7 Hz,H-12),3.15(1H,dd,J= 11.6,4.6 Hz,H-18),1.04～0.98(3H,s,H-23)0.78(3H,s,H-24);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:40.8(C-1),27.9(C-2),79.7(C-3),40.4(C-4),56.7(C-5),19.5(C-6),34.3(C-7),40.4(C-8),48.6(C-9,C-17),39.8(C-10),24.1(C-11,C-27),126.9(C-12),139.7(C-13),43.2(C-14),28.8(C-15),25.3(C-16),54.4(C-18),40.0(C-19),38.1(C-20),31.8(C-21),38.1(C-22),29.2(C-23),16.0(C-24),16.4(C-25),17.7(C-26),181.8(C-28),17.8(C-29),21.6(C-30)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[19]鑒定該化合物為熊果酸。

化合物10白色粉末狀固體;ESI-MS:m/z331.2[M+Na]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.22(1H,d,J= 17.3 Hz,H-15),5.03(1H,d,J= 10.7 Hz,H-15′),1.28～1.22(3H,m,H-16),1.19～1.11(3H,m,H-17),0.86(3H,s,H-20),0.78(6H,s,H-18,H-19);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.8(C-1),18.6(C-2),42.1(C-3),33.4(C-4),56.2(C-5),19.3(C-6),44.6(C-7),24.7(C-8),61.7(C-9),39.4(C-10),20.7(C-11),45.1(C-12),74.9(C-13),146.1(C-14),111.4(C-15),21.6(C-16),27.6(C-17),33.5(C-18),24.4(C-19),15.5(C-20)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[20]鑒定該化合物為香紫蘇醇。

化合物11白色粉末狀固體;ESI-MS:m/z251.2[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:2.44～2.36(1H,m,H-11),2.23(1H,dd,J= 16.2,6.5 Hz,H-11′),2.07(1H,dt,J= 11.9,3.4 Hz,H-9),1.97(1H,dd,J= 14.8,6.5 Hz,H-7),1.88(1H,dq,J= 14.3,3.2 Hz,H-6);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.6(C-1),18.2(C-2),42.3(C-3),33.3(C-4),56.8(C-5),20.7(C-6),38.9(C-7),86.6(C-8),59.3(C-9),36.2(C-10),28.9(C-11),177.1(C-12),21.7(C-13),33.3(C-14),21.1(C-15),15.2(C-16)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[21]鑒定該化合物為香紫蘇內(nèi)酯。

化合物12灰白色粉末狀固體;ESI-MS:m/z139.2[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:9.69(1H,s,H-7),6.91(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:131.1(C-1),114.8(C-2),146.1(C-3),153.7(C-4),115.8(C-5),126.4(C-6),193.1(C-7)。基于以上數(shù)據(jù)及與文獻[22]鑒定該化合物為原兒茶醛。

化合物13白色針晶(MeOH);ESI-MS:m/z155.1[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.44(1H,s,H-2),6.79(1H,d,J= 8.3 Hz,H-5);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:122.9(C-1),117.6(C-2),145.8(C-3),151.2(C-4),115.6(C-5),123.8(C-6),170.1(C-7)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[22]鑒定該化合物為原兒茶酸。

化合物14白色粉末狀固體;ESI-MS:m/z411.7[M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:3.64(2H,t,J= 7.7 Hz,H-1),1.27～1.22(52H,brs,26×CH2);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:63.3(C-1),33.0(C-2),25.9(C-3),29.9～29.5(22×CH2),32.1(C-26),22.8(C-27),14.3(C-28)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[23]鑒定該化合物為二十八烷醇。

化合物15白色針晶(MeOH);ESI-MS:m/z193.1[M+Na]+。1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.06(2H,s,H-2,H-6);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:121.7(C-1),110.2(C-2,6),146.0(C-3,5),139.3(C-4),170.2(C-7)。基于以上數(shù)據(jù)及文獻[15]鑒定該化合物為沒食子酸。

化合物1～15結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～15的化學結(jié)構(gòu)

2.2 細胞毒活性

實驗結(jié)果表明,在100 μmol/L濃度下化合物1～3、5～7、10～15對MDA-MB-231、MCF-7和4T1三種乳腺癌細胞增殖的抑制率均低于50%。化合物4、8和9對上述3種乳腺癌細胞的增殖均有一定的抑制作用,結(jié)果見表1。

表1 化合物1～15體外抗乳腺癌細胞活性的IC50

3 結(jié)論

本課題組前期研究[8]發(fā)現(xiàn)尖尾芋醇提物石油醚部位具有良好的抗乳腺癌活性,其機制與抑制MAPKs通路p-ERK/ERK的表達有關(guān),但尖尾芋醇提物石油醚部位抗乳腺癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此,本研究從尖尾芋根莖石油醚部位中分離得到16個化合物,這些化合物包括酯類(肉豆蔻酸甲酯、香草酸乙酯)、萜類(角鯊烯、齊墩果酸、熊果酸、香紫蘇醇、香紫蘇內(nèi)酯)、苯丙素類(對羥基苯甲醛、7-羥基香豆素)、多酚類(沒食子酸乙酯、原兒茶醛、原兒茶酸)、芳香酸類(苯甲酸)、脂肪醇類(二十八烷醇)以及酚酸類(沒食子酸),其中化合物2～15為海芋屬首次分離得到,所有化合物均為尖尾芋首次分離得到。體外抑制乳腺癌細胞增殖實驗結(jié)果表明,化合物4、8、9對人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞及小鼠乳腺癌4T1細胞增殖均有一定的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)[24-27],齊墩果酸、熊果酸及沒食子酸乙酯能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖和擴散,誘導腫瘤細胞凋亡,其抗腫瘤作用可能與其調(diào)節(jié)PI3K/Akt、MAPK、Wnt/β-catenin等信號通路有關(guān),與本課題組前期研究的尖尾芋石油醚部位抗乳腺癌機制相符合。綜上,本研究進一步豐富了尖尾芋石油醚部位化學成分組成,并篩選出其體外抑制乳腺癌細胞增殖的活性成分,為研究尖尾芋石油醚部位抗乳腺癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定的實驗依據(jù)。