響應(yīng)面法優(yōu)化堿法提取狐臭柴葉多糖工藝及生物活性研究

楊丹丹,朱玉昌,周大寨*

1生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院;3湖北民族大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,恩施 445000

狐臭柴(PremnapuberulaPamp)又名長(zhǎng)柄臭黃荊和神仙豆腐柴等,屬于馬鞭草科豆腐柴屬植物,是一種藥食同源的植物[1];狐臭柴葉片含有十分豐富的活性物質(zhì),如黃酮類(lèi)[2]、多酚類(lèi)[3]、揮發(fā)油類(lèi)[4]及多糖類(lèi)[5],具有抗氧化[6]、抑菌[4]、抗腫瘤[7]及抗炎[8]等活性作用。目前狐臭柴葉片研究主要集中在活性成分的提取、藥理作用以及在食品加工方面的應(yīng)用等,葉片中多糖是主要的功能成分,果膠含量高達(dá)35.53%[9]。狐臭柴葉多糖的研究主要集中在酸溶性多糖[10]和水溶性多糖[11]的提取、抗氧化[5]、抗炎[12]等方面,Shi等[5]比較酸提取法、堿提取法和草酸銨超聲輔助提取法對(duì)豆腐柴葉果膠的抗氧化活性影響,結(jié)果表明DPPH自由基、羥基自由基清除能力最佳為堿提取法,抗氧化活性?xún)?yōu)于其他兩種提取方法。狐臭柴葉堿溶性多糖主要研究在多糖的提取[5],并未系統(tǒng)研究提取工藝,而堿溶性多糖的抗腫瘤活性的研究國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。

本文為充分開(kāi)發(fā)利用狐臭柴多糖資源,以狐臭柴葉酸法提取多糖后的殘?jiān)鼮樵?通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行狐臭柴葉堿溶性多糖(alkali-soluble polysaccharide fromPremnapuberulaPamp leaves,PLAP)提取的工藝優(yōu)化,并探討PLAP的體外抗氧化能力和抗腫瘤活性,旨在為狐臭柴資源得到最大利用化及其在功能食品研發(fā)和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所需狐臭柴葉由湖北雄展公司提供,由湖北民族大學(xué)易詠梅教授鑒定為狐臭柴PremnapuberulaPamp的葉片;氫氧化鈉(NaOH)、濃硫酸、苯酚、抗壞血酸(Vc)(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(批號(hào)BCBM1255V,西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司);2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)(批號(hào)KZTCI-AE,梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司);1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素溶液(批號(hào)J104FC0251、IB09FA0003、IA27KA6853,生工生物工程股份有限公司);0.25%胰酶(批號(hào)MA0233-Oct-09G2,大連美侖生物科技有限公司);pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號(hào)8122571,賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司);細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8(批號(hào)22346564,北京蘭杰柯科技有限公司);人A549肺癌細(xì)胞和人HepG2肝癌細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞研究所)。

1.2 儀器與方法

TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司);M200PRO酶標(biāo)儀(帝肯貿(mào)易有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 狐臭柴葉的預(yù)處理

稱(chēng)取一定量的狐臭柴葉,經(jīng)烘干、粉碎過(guò)60目篩,用85%乙醇反復(fù)浸泡4～5次,用丙酮浸泡1～2次脫脂、脫色、除去低聚糖等雜質(zhì)。粉末進(jìn)行55 ℃烘干過(guò)60目篩,即為狐臭柴葉脫脂脫色粉末。通過(guò)酸提取法提取狐臭柴葉酸溶性多糖,提取條件為0.05 mol/L草酸-磷酸氫二鈉pH 2.0的提取液,在料液比1∶31 g/mL、提取溫度60 ℃的磁力攪拌器中水浴提取60 min,5 000 r/min離心15 min,重復(fù)提取三次,殘?jiān)礊樘幚砗玫脑蟼溆谩?/p>

1.3.2 PLAP的提取

PLAP的提取參考Wang等[13]的方法,加以修改;將殘?jiān)?.25 mmol/L NaOH為提取液,在料液比1∶50 g/mL、磁力攪拌器水浴室溫提取110 min,5 000 r/min離心15 min,重復(fù)提取三次,將上清液合并,濃縮至原體積1/3左右,Sevage法[14]除蛋白,80%乙醇進(jìn)行沉淀多糖,5 000 r/min離心15 min,沉淀進(jìn)行冷凍干燥即為狐臭柴葉堿溶性多糖(PLAP)。

1.3.3 PLAP含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定PLAP濃度,以吸光度值為縱坐標(biāo)(y),葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x),制作標(biāo)準(zhǔn)方程,得到線(xiàn)性方程為:y=0.016 6x+0.012 2;R2=0.997 6。通過(guò)公式(1)計(jì)算PLAP提取率(R)。

R=(C×n×V)/(m×10-6)×100%

(1)

式中:C表示PLAP濃度(μg/mL);n表示稀釋倍數(shù);V表示提取液體積(mL);m表示處理后的原料干重(g)。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)研究提取料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)、NaOH濃度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mmol/L)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)PLAP提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇最優(yōu)的3個(gè)水平,進(jìn)行料液比、NaOH濃度、提取時(shí)間的3因素、3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)條件見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平

1.3.6 PLAP抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定:參考Chen等[16]方法,并加以修改;取不同濃度的PLAP溶液1 mL,加入2 mL DPPH 75%乙醇溶液,混勻后避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)吸光度值;對(duì)照組用75%乙醇代替DPPH 75%乙醇溶液;空白組用同體積的蒸餾水代替樣品;以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)公式2)計(jì)算DPPH自由基清除率(RC)。

RC=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

式中:A0表示空白組吸光度值;A1表示樣品組吸光度值;A2表示對(duì)照組吸光度值。

羥基自由基清除能力的測(cè)定:參考Zhang等[17]方法,并加以修改;取不同濃度的PLAP溶液1 mL,分別加入9 mmol/L 1 mL FeSO4·7H2O、1 mL水楊酸和1 mL H2O2溶液,在37 ℃水浴30 min后靜置30 min在510 nm處測(cè)吸光度值;對(duì)照組用蒸餾水代替FeSO4·7H2O和H2O2溶液,無(wú)水乙醇代替水楊酸;空白組用蒸餾水代替樣品溶液;以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)公式(2)計(jì)算羥基自由基清除率。

ABTS自由基清除能力的測(cè)定:參考Cui等[18]方法,并加以修改;取不同濃度的PLAP溶液各1 mL,分別加入2 mL ABTS溶液,避光反應(yīng)60 min在734 nm處測(cè)定吸光度值;對(duì)照組用蒸餾水代替ABTS溶液;空白組用蒸餾水代替樣品溶液;以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)公式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率。

還原能力的測(cè)定:參考Yang等[19]方法,并加以修改;取不同濃度的PLAP溶液各1 mL分別加入pH為7.4的磷酸緩沖溶液2 mL和2 mL 1%鐵氰化鉀在50 ℃水浴15 min后,加入2 mL 10%三氯乙酸,反應(yīng)終止,4 000 r/min 10 min離心,上清液取1 mL加入0.2 mL 1%三氯化鐵和1 mL蒸餾水混勻靜置10 min,在700 nm處測(cè)吸光度值。吸光度值越大,則多糖的總還原能力越強(qiáng)。

1.3.7 PLAP抗腫瘤活性

1.3.7.1 PLAP對(duì)A549和HepG2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法[20]測(cè)定A549和HepG2細(xì)胞增殖抑制率,當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%～90%面積時(shí),棄瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基并加1 mL 0.25%胰酶消化至部分細(xì)胞變圓,加1 mL培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素)終止消化,吹打均勻,制成細(xì)胞懸液,按1∶5稀釋細(xì)胞懸液,每孔100 μL于96孔板中,5%的CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后,棄培養(yǎng)基,加1 mL PBS迅速清洗死細(xì)胞,重復(fù)三次,分別向各孔加入100 μL含不同PLAP濃度(0、1、2、3、4、5、6 mg/mL)的培養(yǎng)基,每組6個(gè)復(fù)孔,5%的CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后,棄培養(yǎng)基,每孔加入100 μL 10% CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)45 min,酶標(biāo)儀450 nm測(cè)吸光度值。通過(guò)公式(3)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(RI)。

RI=[(A2-A0)-(A1-A0)]/

(A2-A0)×100%

(3)

式中:A0表示空白組的吸光度值;A1表示實(shí)驗(yàn)組吸光度值;A2表示對(duì)照組吸光度值。

1.3.7.2 PLAP對(duì)A549和HepG2細(xì)胞遷移率實(shí)驗(yàn)

采用劃痕實(shí)驗(yàn)[21]測(cè)定A549和HepG2細(xì)胞遷移率,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中,濃度為1×105個(gè)/mL,每孔2 mL,于CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h,棄培養(yǎng)基,用100 μL槍頭畫(huà)一條豎穿過(guò)孔的線(xiàn),加1 mL PBS清洗死細(xì)胞,重復(fù)3次,分別加入2 mL用培養(yǎng)基配制PLAP(1、3、5 mg/mL)溶液,空白組加2 mL培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照組加2 mL培養(yǎng)基配制的0.01 mg/mL 5-氟尿嘧啶(5-FU)溶液,分別于0、24 h在倒置顯微鏡下拍照,用Image J軟件測(cè)量各時(shí)間段劃痕間距,通過(guò)公式(4)計(jì)算遷移率(Rm)。

Rm=(A0-A1)/A0×100%

(4)

式中:A0表示0 h劃痕間距值;A1表示24 h劃痕間距值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同料液比對(duì)PLAP提取率的影響,固定NaOH濃度為0.05 mmol/L、提取時(shí)間30 min,改變料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)進(jìn)行PLAP提取的單因素實(shí)驗(yàn),料液比對(duì)PLAP提取率的影響如圖1a所示。隨著料液比的增加,PLAP提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)料液比達(dá)到1∶40 g/mL時(shí),PLAP提取率達(dá)到最高(10.56±0.11)%,此時(shí)繼續(xù)增加料液比,PLAP提取率開(kāi)始降低,其原因可能是過(guò)大的料液比會(huì)導(dǎo)致部分多糖水解[22]。單因素最佳提取料液比為1∶40 g/mL;選擇1∶30、1∶40、1∶50 g/mL作響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同因素對(duì)PLAP提取率的影響

不同NaOH濃度對(duì)PLAP提取率的影響,固定料液比1∶40 g/mL、提取時(shí)間30 min,改變NaOH濃度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mmol/L)進(jìn)行PLAP提取的單因素實(shí)驗(yàn),NaOH濃度對(duì)PLAP的提取率影響如圖1b所示。隨著NaOH濃度的增加,PLAP提取率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),當(dāng)NaOH濃度為0.2 mmol/L時(shí),PLAP提取率達(dá)最高點(diǎn)為(10.06±0.32)%,當(dāng)繼續(xù)增加NaOH濃度時(shí),PLAP提取率下降,堿性過(guò)高的條件下,會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞[23],單因素最佳提取NaOH濃度為0.2 mmol/L;選擇0.15、0.2、0.25 mmol/L作響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

不同提取時(shí)間對(duì)PLAP提取率的影響,固定料液比1∶40 g/mL、NaOH濃度為0.2 mmol/L,改變提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)進(jìn)行PLAP提取的單因素實(shí)驗(yàn),提取時(shí)間對(duì)PLAP提取率的影響如圖1c所示。當(dāng)提取時(shí)間在30～120 min時(shí),提取時(shí)間與多糖提取率呈現(xiàn)正相關(guān),在提取時(shí)間為120 min時(shí),此時(shí)提取率最高為(10.69±0.09)%,當(dāng)提取時(shí)間大于120 min時(shí),多糖提取率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),因此單因素最佳提取時(shí)間為120 min;選擇90、120、150 min作響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面模型分析

以料液比、NaOH濃度、提取時(shí)間三個(gè)因素為自變量,PLAP提取率為響應(yīng)值,通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)PLAP提取條件進(jìn)一步優(yōu)化,PLAP提取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)表2中數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果見(jiàn)表3,模型P<0.000 1(P<0.01)是具有極顯著性的,因變量與自變量線(xiàn)性關(guān)系顯著(R2=0.976 3),模型調(diào)整確定系數(shù)值為0.945 9,模型的失擬項(xiàng)為0.361 7>0.05,不顯著,表明此模型可以分析和預(yù)測(cè)PLAP提取的最佳工藝條件,3個(gè)因素對(duì)PLAP的提取率影響大小依次為B(NaOH濃度)>A(料液比)>C(提取時(shí)間),二次多項(xiàng)回歸方程如下:

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果

Y=11.12+0.171 3A+0.352 5B-0.106 3C-0.007 5AB+0.25AC-0.492 5BC+0.128 0A2+0.150 5B2-0.542C2

各交互項(xiàng)對(duì)PLAP提取率的影響見(jiàn)圖2,3D的曲面圖越陡表明交互作用對(duì)PLAP的提取率影響越大,圖2a為料液比和溫度的交互作用,表面平緩,說(shuō)明料液比與溫度的交互作用對(duì)提取率影響較小,圖2b、2c表面陡峭,說(shuō)明提取時(shí)間和料液比交互作用、提取時(shí)間和NaOH濃度交互作用對(duì)提取率影響較大。

圖2 各因素交互作用對(duì)PLAP提取率影響的響應(yīng)面3D圖

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面預(yù)測(cè)PLAP最佳提取條件為料液比1∶50 g/mL、NaOH濃度0.25 mmol/L、提取時(shí)間110.76 min時(shí),理論上PLAP提取率最高為11.97%。按實(shí)際情況,將時(shí)間調(diào)整為110 min的條件下,經(jīng)過(guò)三次重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后,PLAP提取率平均值為11.80±0.50%,與理論值接近,模型值與理論值誤差為0.17%擬合度較好,說(shuō)明此模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)PLAP的提取。

2.3 PLAP抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

不同濃度的PLAP對(duì)DPPH自由基清除能力如圖3a所示。由如圖3a可知,PLAP具有一定的DPPH自由基清除能力,隨著PLAP濃度的增加清除能力呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)。當(dāng)濃度達(dá)5 mg/mL時(shí),PLAP和Vc清除率分別為(15.18±1.03)%、(96.52±0.23)%,Vc清除率相比PLAP上升百分比為81.34%,PLAP遠(yuǎn)小于Vc的清除率,經(jīng)過(guò)線(xiàn)性擬合,PLAP半數(shù)抑制濃度IC50值為12.38 mg/mL,低于Hu等[24]研究櫻桃核多糖的DPPH自由基清除效果(IC50值0.31 mg/mL)。

圖3 PLAP對(duì)DPPH、羥基、ABTS自由基的清除能力及還原力活性

不同濃度的PLAP對(duì)羥基自由基清除能力如圖3b所示。由如圖3b可知,在1.0～5.0mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,PLAP清除率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí),Vc清除率為(98.48±0.31)%,PLAP清除率為(64.6±2.45)%,PLAP清除率與Vc相比下降百分比為33.88%,Vc清除效果優(yōu)于PLAP,PLAP清除羥基自由基的IC50值為3.22 mg/mL,Feng等[25]研究海藻多糖的抗氧化活性,紫菜多糖羥基自由基清除率IC50值為26.59 mg/mL,PLAP優(yōu)于紫菜多糖清除羥基自由基能力。

不同濃度的PLAP對(duì)ABTS自由基清除能力如圖3c所示。由如圖3c可知,在0.2～1.0 mg/mL的范圍內(nèi),隨著濃度的增加,清除效果明顯增加,在濃度為1.0 mg/mL時(shí),PLAP清除率為(97.87±1.11)%,Vc清除率為(99.36±0.11)%,此時(shí)清除率與Vc相接近,PLAP對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50值為0.18 mg/mL。

不同濃度PLAP還原能力的強(qiáng)弱如圖3d所示。由如圖3d可知,PLAP隨著濃度的增加,還原能力明顯增加,在濃度5 mg/mL時(shí),PLAP在700 nm處吸光度值為0.627。

2.4 PLAP抗腫瘤活性

2.4.1 A549和HepG2細(xì)胞增殖抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PLAP對(duì)A549肺癌和HepG2細(xì)胞增殖抑制作用如圖4a和4b所示,采用CCK-8法測(cè)定不同給藥濃度下處理A549和HepG2細(xì)胞48 h的增殖抑制率,不同濃度的PLAP對(duì)A549和HepG2均有增殖抑制的效果,并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,PLAP對(duì)A549肺癌細(xì)胞在不同處理濃度下均有顯著性差異(P<0.05);PLAP對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞也均有顯著性差異(P<0.05),在PLAP濃度為6 mg/mL時(shí),對(duì)A549和HepG2細(xì)胞抑制率分別為(82.60±1.05)%和(77.37±1.48)%。

圖4 PLAP對(duì)A549和HepG2細(xì)胞的增殖和遷移作用的影響

2.4.2 A549和HepG2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PLAP對(duì)A549肺癌和HepG2肝癌細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4c和4d所示,PLAP對(duì)A549和HepG2細(xì)胞有一定的抑制遷移效果,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,不同劑量組的PLAP對(duì)A549肺癌細(xì)胞與空白相比較均有顯著性差異(P<0.05),與陽(yáng)性對(duì)照5-FU相比較具有顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明不同濃度的PLAP有一定抑制遷移效果,但與陽(yáng)性對(duì)照有一定差距;不同劑量組的PLAP對(duì)HepG2細(xì)胞與空白組相比較有顯著性差異,說(shuō)明PLAP可抑制HepG2細(xì)胞遷移,PLAP與5-FU相比較,當(dāng)PLAP濃度為1 mg/mL具有顯著性差異(P<0.05),當(dāng)濃度為3和5 mg/mL時(shí),無(wú)顯著性差異。表明PLAP具有較好的抑制A549肺癌和HepG2肝癌細(xì)胞遷移效果。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以狐臭柴葉片通過(guò)酸提取法提取后殘?jiān)鼮樵?采用NaOH溶液為提取液,通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到PLAP的最佳提取工藝:液料比1∶50 g/mL、NaOH濃度為0.25 mmol/L、提取時(shí)間110 min、此條件下PLAP提取率為(11.80±0.50)%;PLAP的抗氧化能力較好,其中對(duì)ABTS自由基、羥基自由基、DPPH自由基的IC50值分別為0.18、3.22、12.38 mg/mL;抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明,PLAP對(duì)A549和HepG2細(xì)胞增殖具有一定抑制效果,均呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)(P<0.05),PLAP對(duì)A549和HepG2細(xì)胞遷移抑制效果較好,與空白組對(duì)比,均有顯著性差異;本研究使狐臭柴葉多糖資源利用達(dá)到最大化,狐臭柴經(jīng)順序提取得到的PLAP具有較高的生物活性,可為食品加工、醫(yī)藥領(lǐng)域的研究提供理論支撐。