基于網絡藥理學及體外實驗探究野蠶豆根抗氧化活性及其作用機制

劉鑫瀾,朱朋艷,馬金蓉,王星月 ,韋 茜,高艷梅,張冬英*,袁文娟*

1云南農業大學食品科學技術學院;2云南農業大學理學院,昆明 650201;3云南省紅河州食品藥品檢驗所,蒙自 661199

野蠶豆根,為玄參科(Scrophulariaceae)胡麻草屬(Centranthera)植物大花胡麻草(CentrantheragrandifloraBenth)的根,主要分布在云南、貴州、廣西等地[1,2]。野蠶豆根為藥食同源類植物,富含多種活性物質,如環烯醚萜、苯乙醇苷、紫羅蘭酮、類胡蘿卜素、單萜等多類化合物[3,4],具有抗氧化、抗炎、抗凝血和心肌缺血以及促進傷口愈合等生理活性[5-7]。古籍記載用其泡酒,來防治腦血栓、腦梗等疾病[8]。在云南被當作彝族藥材種植,廣泛用于民族醫藥。目前的研究主要集中在野蠶豆根的提取分離,以及活性研究[9]。野蠶豆根富含環烯醚萜苷類物質,具有抗氧化、降脂保肝以及預防心腦血管疾病的功效[10,11],具有很大的開發潛力。

氧化應激是指機體受到刺激,造成體內產生過多的活性氧(reactive oxygen species,ROS),導致與抗氧化物的失衡,從而引起的一種應激狀態[12],能夠引發心血管疾病、神經系統疾病和癌癥等[13]。由于加工合成的抗氧化劑會對健康產生潛在的危害,因此人們更加致力于去尋求天然的抗氧化劑[14,15]。天然抗氧化劑具有療效顯著、毒副作用較低等特點[16],越來越受到人們關注。野蠶豆根作為一種天然藥物,具有良好的抗氧化活性,但關于其具體的活性成分及作用機制研究較少。

網絡藥理學是從系統層面揭示藥物在機體中的調節網絡的一門新興學科。通過構建“藥物、活性成分、靶點、疾病”之間的復雜網絡關系,可以預測藥物的作用機制,尤其適用于中藥開發的多靶點藥物的作用機制預測[17]。本文借助網絡藥理學分析了野蠶豆根的主要活性成分及成分靶點,深入探討其抗氧化作用的分子機制,并通過體外抗氧化實驗以及生物學手段進行了驗證,為深入開展野蠶豆根基礎實驗研究提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 數據庫與軟件

TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、Swiss target prediction數據庫(http://www.Swisstargetprediction.ch)、PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt數據庫(https://www.uniprot.org)、OMIM數據庫 (https://www.omim.org)、Genecards 數 據 庫 (https://www.genecards.org)、VENNY 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)、微生信在線平臺 (http://www.bioinformatics.com.cn)、STRING數據庫(https://cn.string-db.org)、蛋白質結構數據庫 (https://www.alphafold.ebi.ac.uk)、Cytoscape 3.8.0、AutoDockTools 1.5.7、PyMOL。

1.1.2 實驗試劑與儀器

野蠶豆根采自云南省屏邊縣和平鄉鎮,由云南省紅河州食品藥品檢驗所高艷梅老師鑒定為玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth的根。C2C12小鼠成肌細胞(云南農業大學普洱茶教育部重點實驗室細胞庫);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(批號:CU6GJC-ZG)、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)(批號:C15513541)、RIPA裂解液(批號:20230309)(索萊寶生物公司);兔抗PI3K抗體(貨號:4249S)、p-PI3K抗體(貨號:17366S)、AKT抗體(貨號:9272S)、p-AKT抗體(貨號:4060S)(CST公司);胎牛血清(批號:1010D053,美國賽默飛世爾科技公司);PVDF膜(批號:A30683441,Millipore公司);脫脂奶粉(批號:D6340,BD公司);VC(批號:1007101)、水楊酸(批號:20191101)、硫酸亞鐵(批號:20201011)、無水乙醇(批號:20230701)、過硫酸鉀(批號:20190103)(分析純,天津大茂化學試劑廠)。

BSA224W-CW型萬分之一電子天平(Sartorius公司);CO2氣體培養箱(BINDER公司);超凈工作臺(AIRTECH公司);Multiskan Mk3型酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 野蠶豆根體外抗氧化實驗驗證

1.2.1.1 野蠶豆根提取物的制備

將1 kg干燥的野蠶豆根藥材研磨成粗粉,用60%的乙醇,在溫度為50℃下超聲提取1 h,重復3次,后減壓濃縮得到浸膏337.5 g,留存備用。

精密稱取野蠶豆根提取物(the extract ofC.grandifloraBenth roots,CGE)適量,用乙醇溶解并稀釋到一定體積,制成濃度依次為10、20、40、80、160、320 μg/mL的溶液用作抗氧化活性研究。

1.2.1.2 DPPH法測定抗氧化活性

精密吸取100 μL不同濃度的野蠶豆根提取物溶液(10、20、40、80、160、320 μg/mL)和100 μL 0.3 mmol/L DPPH無水乙醇溶液,放入96孔板中,經均勻混合后,于37 ℃下,避光保存30 min,在波長517 nm處檢測吸光值A1。用100 μL無水乙醇溶液代替DPPH溶液測得吸光值A2。同時測得100 μL DPPH的無水乙醇溶液和100 μL無水乙醇溶液在該條件下的吸光值Ad。采用VC作為陽性對照。每份樣品平行實驗3次。DPPH自由基清除率(R)按公式(1)進行計算。

R=[1-(A1-A2)/Ad]×100%

(1)

1.2.1.3 ABTS法測定抗氧化活性

精密吸取100 μL不同濃度的野蠶豆根提取物溶液(10、20、40、80、160、320 μg/mL)和100 μL ABTS工作液,置96孔板中,經均勻混合后,于37 ℃下,避光保存30 min,在波長734 nm處檢測吸光值A3。用100 μL水代替ABTS工作液測得吸光值A4。同時測得100 μL ABTS工作液和100 μL水的混合液在該條件下的吸光值Aa。采用VC作為陽性對照。每份樣品平行實驗3次。ABTS自由基清除率(R)按公式(2)計算。

R=[1-(A3-A4)/Aa]×100%

(2)

1.2.1.4 清除羥自由基能力測定

精密吸取100 μL不同濃度的野蠶豆根提取物溶液(10、20、40、80、160、320 μg/mL)放入96孔板中,同時加入濃度為6.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液和10.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各100 μL,再加6.0 mmol/L的H2O2溶液100 μL,置于37 ℃下,避光放置10 min,在波長510 nm下檢測吸光度A5。蒸餾水作為樣品對照A6,樣品溶劑作為空白對照Ao。以VC作陽性對照。每個樣品平行實驗3次。羥自由基清除率(R)按公式(3)計算。

R=[1-(A5-A6)/Ao]×100%

(3)

1.2.2 野蠶豆根抗氧化機制的網絡藥理學預測

1.2.2.1 藥物成分潛在靶點預測

在TCMSP數據庫以及知網、萬方和PubMed等平臺進行文獻檢索,挖掘出野蠶豆根中的化學成分。從Pubchem網站中下載這些化合物的Smile格式,然后在Swiss target prediction數據庫中,以物種 “Homo sapiens”,以Probability>0.01為條件篩選成分靶點。利用Uniprot數據庫規范與作用成分相關的靶點蛋白,獲得靶點對應的基因名[18]。

1.2.2.2 疾病分子靶點預測

通過OMIM數據庫、GeneCards數據庫,輸入“oxidative”檢索相關靶點,去重匯總后得到氧化應激的相關作用靶點。將野蠶豆根的成分靶點和氧化應激的作用靶點利用Venny 2.1.0作韋恩圖,獲得共同靶點。

1.2.2.3 蛋白互作網絡分析

在STRING數據庫上對得到的交集靶點進行可視化分析。在過濾條件為“Homo sapiens”的情況下,得到了蛋白互作網絡(protein-protein interaction networks,PPI)。借助Cytoscape 3.8.0分析獲得的PPI網絡數據信息,使用拓撲學方法并根據度值(degree centrality,DC)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)來確定核心靶點[17]。

1.2.2.4 GO和KEGG分析

利用cluster Profiler等R語言,進行交集靶點的基因本體(Gene Ontology,GO)分析以及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。一般選取P值<0.01的GO、KEGG項目,來進行顯著分析[18]。利用Cytoscape 3.8.0軟件,構建野蠶豆根的“活性成分-作用靶點-通路”圖。

1.2.2.5 分子對接

利用PubChem數據庫,對野蠶豆根中的化學成分中進行檢索,下載對應3D結構的SDF文件。在蛋白質結構數據庫中下載靶蛋白結構的PDB文件。然后利用AutoDock 1.5.7軟件對靶點蛋白等進行去水、加氫等修飾,之后進行分子對接以及計算最小結合能。用Affinity(kcal/mol)值,來評價結合能力。Affinity數值越低,代表配體與受體結合越穩定。之后再通過Pymol進行可視化操作。

1.2.3 野蠶豆根抗氧化作用機理驗證

1.2.3.1 細胞培養

將C2C12細胞復蘇后,在含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養液進行培養觀察。當細胞生長狀態到80%左右,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。之后在含5%CO2的37 ℃恒溫培養箱中進行培養換液,根據細胞狀態及密度定期進行換液或傳代。

1.2.3.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)驗證

取對數生長期C2C12細胞,接于60 mm細胞培養皿中,設置成6組,即:空白對照組、VC陽性對照組(10 μg/mL)、過氧化氫模型組(600 μmol/L H2O2)、野蠶豆根提取物低、中、高(200、300、400 μg/mL)劑量組。造模和用藥時,模型組更換為含有H2O2的培養基,野蠶豆根提取物組為低、中、高處理組的培養基預處理20 h,再更換為含有H2O2的培養基處理4 h。

用RIPA緩沖液在冰上裂解不同組的C2C12細胞,在裂解液中提取總蛋白,然后使用BCA定量。后經10% SDS-PAGE電泳,在PVDF膜上進行轉移,使用5%脫脂牛奶進行封閉操作。TBST洗膜后,在4 ℃搖床上孵育一抗PI3K(1∶750)、p-PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶500)、β-tublin(1∶2 000) 16～24 h。TBST洗膜3次,每次5 min,隨后室溫下加入HRP標記的兔抗(1∶5 000)孵育1 h。TBST洗膜3次,每次5 min;加入ECL發光液,分別采用全自動成像分析系統和Image J軟件進行顯影和分析。以β-tublin為內參,分析相關蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 野蠶豆根體外抗氧化實驗驗證

2.1.1 DPPH法測定抗氧化活性

由圖1A可知,野蠶豆根提取物溶液和VC溶液的DPPH自由基清除能力均隨濃度增加而增強,且VC溶液的清除能力較好。隨著濃度的增加,野蠶豆根提取物溶液的DPPH自由基清除能力在逐步接近VC溶液。在80 μg/mL后,清除能力顯著增加。在320 μg/mL時野蠶豆根提取物溶液的清除能力較強,清除率為73.86%。同時,經擬合計算得到野蠶豆根提取物溶液對DPPH自由基的IC50值為0.166 mg/mL,表現出較強的抗氧化活性。

2.1.2 ABTS法測定抗氧化活性

由圖1B可知,野蠶豆根提取物溶液和Vc溶液的ABTS自由基清除能力均隨濃度增加而增強,濃度在10～320 μg/mL范圍時清除率與提取液和Vc濃度呈正相關。在320 μg/mL時,野蠶豆根提取物溶液的清除率達到83.89%。同時,經擬合計算得到野蠶豆根提取物溶液對ABTS自由基的IC50值為0.054 mg/mL,表現出較強的抗氧化活性。

2.1.3 羥自由基清除能力

由圖1C可知,野蠶豆根提取物溶液和VC溶液對羥自由基都有著較好的清除效果。可以看出濃度在10～80 μg/mL范圍內,野蠶豆根提取物溶液表現出和VC溶液接近的清除能力。濃度在80 μg/mL后,野蠶豆根提取物溶液和VC溶液的清除能力都隨著濃度顯著增加。在320 μg/mL時,野蠶豆根提取物溶液的清除率59.15%。雖然野蠶豆根提取物溶液對羥自由基的清除能力相對較低,但是其仍能達到60%左右的清除率,可表明其是一種清除羥自由基的有效成分。同時,經擬合計算得到野蠶豆根提取物對羥自由基的IC50值為0.180 mg/mL,表現出較強的抗氧化活性。

2.2 野蠶豆根活性成分與靶點

通過TCMSP數據庫以及文獻檢索,去除無效成分后,篩選得到了22個野蠶豆根活性成分(見表1)。同時獲得了86個活性成分的作用靶點。

表1 野蠶豆根的活性成分信息

2.3 野蠶豆根抗氧化應激靶點的獲取

在OMIM數據庫、GeneCards數據庫中,共篩選得到了14 187個氧化應激的疾病靶點。將其與86個藥物活性成分靶點取交集,構建韋恩圖(見圖2),共得到82個交集靶點。

圖2 野蠶豆根活性成分與氧化應激交集靶點

2.4 藥物分子-疾病靶點PPI網絡構建

運用STRING數據庫,對野蠶豆根治療氧化應激的82個交集靶點進行蛋白互作分析,構建PPI網絡,并在Cytoscape3.8.0中進行可視化分析(見圖3)。結果共獲得75個節點和212條節點之間的連線。節點是野蠶豆根與氧化應激交集靶點編碼的蛋白,節點間的連線即為度(degree)。節點的連線越多,表示相互作用越多,靶點的作用越重要[17]。圖中圓形面積越大表示其相連的靶點越多,度值越高。為了進一步篩選PPI網絡中的核心靶點蛋白,在Cytoscape3.8.0中對PPI網絡的節點進行拓撲學分析,選擇出大于DC、BC、CC中位數的目標值。共得到STAT3、HSP90AA1、HDAC1、PPARG等23個核心靶點(見表2)。

表2 PPI網絡核心靶點

圖3 蛋白-蛋白互相作用圖

2.5 GO和KEGG富集通路分析

對野蠶豆根治療氧化應激的82個交集靶點進行GO富集分析。GO分析包括生物過程(biological process,BP)、細胞組成(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3個部分。結果共得到了3 386個GO富集條目,其中有2 847個條目與生物過程方面有關,188個條目與細胞組成方面相關、351個條目與分子功能方面有關。由P值從小到大,排列出每個部分的前10個條目(見圖4)。在生物過程方面,野蠶豆根主要參與細胞內受體信號通路(intracellular receptor signaling pathway)、核苷生物合成過程(nucleoside biosynthetic process)、糖基化合物代謝過程(glycosyl compound metabolic process)、RNA聚合酶ll啟動子的轉錄起始(transcription initiation from RNA polymerase ll promoter)、糖基化合物生物合成過程(glycosyl compound biosynthetic process)等過程。在細胞組成方面,野蠶豆根主要作用于細胞質囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、富含纖維膠凝蛋白-1的顆粒管腔(ficolin-1-rich granule lumen)、囊泡腔(vesicle lumen)、溶酶體腔(lysosomal lumen)、富含纖維膠凝蛋白-1的顆粒(ficolin-1-rich granule)等部位。在分子功能方面,野蠶豆根主要富集在碳水化合物結合(carbohydrate binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、轉錄輔激活因子結合(transcription coactivator binding)、單糖結合(monosaccharide binding)、配體活化轉錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)等。

圖4 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析共富集到了相關通路211條。由P值進行排序,篩選出排名前10名的通路,并作出氣泡圖(見圖5)。結果顯示,野蠶豆根抗氧化應激的作用靶點主要富集在PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化學致癌-受體激活(chemical carcinogenesis-receptor activation)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、脂質與動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)等通路。

圖5 KEGG信號通路富集分析

2.6 野蠶豆根“活性成分-作用靶點-通路”網絡的構建

為了進一步探究作用機制,構建了野蠶豆根“活性成分-作用靶點-通路”圖(見圖6)。結果可見,野蠶豆根內單一活性成分可作用多個靶點,不同的靶點也會包含于不同的活性成分中,且參與多條通路。說明野蠶豆根可能通過多成分、多靶點、多通路調控和抑制氧化應激的發生。

圖6 野蠶豆根“活性成分-作用靶點-通路”網絡

2.7 分子對接驗證

為進一步明確野蠶豆根抗氧化應激的活性成分與關鍵靶點之間的結合效應,選取了部分活性成分與“活性成分-靶點-通路”網絡中前3個的關鍵靶點STAT3、HDAC1及HSP90AA1進行分子對接(見表3)。通常認為,分子對接結合能小于0時說明兩分子具有自發結合能力,分子對接結合能小于-1.2 kcal/mol時則表明兩分子結合良好[17]。結果顯示,所有對接的活性成分與靶點均具有良好的結合活性。杜鵑紅素和β-谷甾醇的結合能最低,其中杜鵑紅素為野蠶豆根中的特征性成分,因此在Pymol軟件中選取杜鵑紅素完成可視化分析,分析具體結合情況(見圖7)。

表3 作用成分與核心靶點對接的結合能

圖7 杜鵑紅素與靶蛋白的分子對接過程

2.8 Western blot檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達

在本次實驗中,采用體外抗氧化模型已驗證了野蠶豆根具有較好的抗氧化活性。同時,通過KEGG通路富集,發現PI3K/Akt信號通路與野蠶豆根抗氧化應激密切相關。因此采用Western blot對PI3K-Akt通路的相關蛋白的表達進行檢測。結果顯示,與過氧化氫模型組相比,野蠶豆根提取物低、中、高處理組細胞中 p-PI3K和p-Akt(Ser473)的表達水平均被顯著上調(P<0.05)(見圖8),起到抗氧化作用。

圖8 野蠶豆根提取物對關鍵蛋白表達的影響

3 討論與結論

野蠶豆根是我國的一種傳統中藥,含有環烯醚萜類、苯乙醇類、類胡蘿卜素類等多種活性物質,具有抗氧化、降糖、抗凝血和心肌缺血等多種藥理活性。目前,對于野蠶豆根抗氧化活性的研究也在逐漸深入,但關于其具體的活性成分和機制還尚未發掘。為了進一步探究野蠶豆根抗氧化應激的作用機制,本文借助體外抗氧化實驗、網絡藥理學、分子對接技術以及Western blot檢測對其進行進一步研究。

通過體外抗氧化實驗,發現了野蠶豆根提取物具有DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基的清除能力,且在一定濃度范圍內,野蠶豆根提取物的三種自由基清除率具有一定的線性關系。在濃度為320 μg/mL時,3種自由基的清除率分別為73.86%、83.89%、59.15%,IC50值分別為0.166 mg/mL、0.054 mg/mL 和0.180 mg/mL,表現出良好的抗氧化能力。

通過文獻以及相關數據庫的篩選,得到了22個野蠶豆根的活性成分,包括桃葉珊瑚苷、杜鵑紅素、β-谷甾醇、梔子新甙甲酯、梓醇等。其中桃葉珊瑚苷在野蠶豆根中含量最高,具有抗氧化、抗菌、抗癌等廣泛的活性[19]。Nrf2是抗氧化應激的核心轉錄因子,調控下游抗氧化因子的激活和表達,維持細胞穩態[20]。有研究發現桃葉珊瑚苷可通過Nrf2介導的抗氧化途徑來抑制小鼠破骨細胞的分化,從而減緩骨質疏松的發展[21]。杜鵑紅素是一種天然的類胡蘿卜素,是野蠶豆根中的重要活性成分。研究發現,野蠶豆根中的杜鵑紅素可以通過增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性等,來發揮對細胞氧化應激損傷的保護作用。同時,還可以通過激活Nrf2-ARE通路,起到對心肌損傷的保護活性[5]。梓醇是也是一類環烯醚萜苷類的化合物,具有抗炎、抗氧化等廣泛的藥理活性。研究發現,梓醇還可通過上調Nrf2和HO-1的表達,增加SOD的活性,降低MDA的活性,減少腦細胞凋亡的發生,促進Bcl-2蛋白的表達,抑制Bax蛋白的表達,減輕氧化應激損傷[22]。

在蛋白互作網絡分析中,獲得了野蠶豆根活性成分抗氧化應激的82個作用靶點。主要包括STAT3、HSP90AA1、HDAC1、PPARG、HSPAB1等23個核心靶點。熱休克蛋白(HSPs)是一種分子伴侶蛋白,它可以改變其他蛋白質的結構和相互作用,并由熱休克和其他化學和物理應激誘導[23]。HSP90AA1和HSP90AB1同屬于HSPs中的HSP90家族。當發生氧化應激時,會激活細胞內熱休克蛋白的表達。研究發現,HSP90可通過調節Keap1(INrf2)-Nrf2信號途徑來調節機體的氧化損傷。在氧化應激的狀態下,HSP90會與Keap1發生相互反應,促使Keap1與Nrf2復合物的解離,從而釋放Nrf2。通過Nrf2及其下游蛋白的轉錄激活來保護細胞免受氧化應激[24,25]。STAT3是氧化應激后細胞存活的重要介導因子,具有強大的增殖作用和凋亡抵抗作用[26]。研究表明,STATA3可以通過上調抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達以及促進caspases的失活,來發揮其細胞保護作用[27,28]。HDAC1是一類催化組蛋白和非組蛋白去乙酰化的酶,能夠通過組蛋白和轉錄因子的去乙酰化降低抗氧化酶的表達[29]。同時有研究發現,抑制HDAC1的表達可以通過改善細胞活力以及增加SOD活性等,防止化學缺氧誘導的H9c2細胞氧化應激失衡[30]。

KEGG富集分析表明野蠶豆根發揮抗氧化能力主要與PI3K/Akt信號通路、核苷酸代謝通路、雌激素信號通路等有關。其中PI3K/Akt信號通路在抗氧化應激中有著重要地位它廣泛存在于哺乳動物中細胞中,具有良好的神經保護性。PI3K/Akt信號通路的激活將促進Akt級聯的磷酸化,防治氧化損傷[31]。研究表明,通過調控PI3K/Akt信號通路,可以改善軟骨細胞以及H9c2心肌細胞的凋亡和氧化應激[32,33]。

分子對接結果顯示,野蠶豆根的活性成分與核心靶點間存在良好的結合效應,其相互結合能力較強,作用密切。

PI3K屬于細胞質脂類激酶。當PI3K磷酸化的同時,會招募并引起Akt的磷酸化,從而調控氧化應激、凋亡等生理活動[31]。Western blot檢測結果發現,野蠶豆根正丁醇提取物能夠促進蛋白PI3K以及Akt的磷酸化,從而激活PI3K/Akt信號通路,改善氧化應激。

綜上所述,本文采用體外抗氧化實驗對野蠶豆根的抗氧化活性進行了評價。借助網絡藥理學、分子對接技術對野蠶豆根抗氧化應激的活性成分、作用靶點、信號通路等進行了預測。最后利用Western blot檢測對其作用機制加以驗證。結果表明,野蠶豆根提取物清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基的IC50值分別為0.166、0.054和0.180 mg/mL,驗證了其具有良好的抗氧化活性。網絡藥理學結果顯示,野蠶豆根可通過多成分、多靶點、多通路來改善氧化應激,其中PI3K/Akt信號通路可能是其發揮抗氧化作用的關鍵通路。Western blot檢測進一步發現,野蠶豆根提取物可通過促進PI3K/Akt信號通路中相關蛋白的磷酸化從而激活該通路,發揮抗氧化活性,進而驗證了野蠶豆根抗氧化應激的作用機制,為野蠶豆根在抗氧化應激作用的深入研究上提供了方向以及奠定了基礎。