不同產地甘草中核苷和堿基類成分分析與評價

謝明霞,朱正清,陳 思,杜 可,王 芷,郭東衛,王漢卿

1湖南中醫藥大學,長沙 410208;2湖南省腦科醫院(湖南省第二人民醫院),長沙 410021;3寧夏醫科大學,銀川 750004

中藥甘草始載于《神農本草經》,來源于豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFishch.、脹果甘草G.inflatBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖[1],為藥食同源之品。據報道,市售90%以上的甘草藥材其基原植物為甘草G.uralensisFishch.[2]。現代藥理研究表明,甘草具有抗病毒、抗炎、保肝、抗糖尿病、抗腫瘤等活性[3]。化學研究表明,甘草中主要含有黃酮類、三萜類、苯丙素類及多糖等成分,目前共計分離獲得了244個化合物[4]。“諸藥所生,皆有其境”強調了生態環境對藥材品質影響,基于此,研究不同生境下藥材中化學成分差異,對于評價藥材質量,保障其療效具有重要意義。野生和栽培甘草由于所受外界環境脅迫不同,課題組前期研究結果顯示,二者之間淀粉、纖維等大分子物質及芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草酸等黃酮、三萜皂苷類成分存在差異[5,6]。針對不同產地甘草中化學成分的研究,課題組報道了基于非靶標代謝組學結合化學計量學可以區分不同產地甘草[7]。核苷類成分是生命中必不可少的物質,是細胞的重要組成部分,是新陳代謝的核心[8-9]。核苷類似藥物在人類健康中起著關鍵作用,這些小分子藥物參與病毒或癌細胞生命周期中DNA或RNA復制過程中酶的相互作用,使其用于抗病毒、抗癌、抗菌等[10]。全面分析植物提取物中核苷類成分是研究植物中核苷的有效途徑[11]。然而,目前尚缺乏對甘草中核苷、堿基類成分的研究,對于不同產地甘草中核苷、堿基類成分是否存在差異,進而影響其療效尚未見報道。

本研究采用UPLC-TQ/MS測定不同產地甘草中核苷、堿基類成分含量,并基于其含量數據,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)分析不同產地甘草差異,為其合理開發利用奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC系統(Waters公司);Xevo TQ-S質譜儀(Waters公司);MassLynxTM XS 質譜工作站(Waters公司);BT125型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);Milli-Q超純水系統(默克密理博公司);KQ-250E型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

甘草藥材采自寧夏、甘肅、內蒙古和新疆四個產區,采集三年生甘草的根和根莖,曬干,共計153批次,包括寧夏45個樣本、甘肅26個樣本、內蒙古61個樣本、新疆21個樣本,經寧夏醫科大學藥學院生藥系王漢卿教授鑒定為甘草GlycyrrhizauralensisFishch.的根及根莖。

化學對照品:鳥嘌呤(Gua)(批號BCBM438 0V)、胸苷(Thyd)(批號041M0151)、2′-脫氧胞苷(2′-dC)(批號AF9033002)、腺嘌呤(Ade)(批號SLBF5824)、次黃嘌呤(Hyp)(批號SLBD4750)、尿苷(Uri)(批號SLBD3297)、胞苷-5′-環磷酸(C-5′P)(批號SLBH2408V)、黃嘌呤(Xan)(批號SLBD5517)、胞苷(Cytd)(批號BCBL5271)、鳥苷(Guad)(批號SLBF4484)、胞嘧啶(Cyt)(批號SLBF0582)、胸腺嘧啶(Thym)(批號WXBB0684)均購于Sigma公司,純度≥98%。色譜級乙腈和甲酸購于德國默克公司,超純水由Milli-Q超純水儀自制,其他試劑均為國產分析純。

2 方法和結果

2.1 供試品溶液制備

精密取甘草樣品粉末(過50目篩)約0.5 g,置于50 mL具塞錐形瓶中,精密加入20 mL水,室溫超聲提取(100 kHz)30 min,補足減失重量,13 000 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm濾膜,續濾液備用。

2.2 對照品溶液制備

分別取各對照品適量,精密稱定,加水配制成混合對照品儲備溶液,Gua、Thyd、2′-dC、Ade、Hyp、Uri、C-5′P、Xan、Cytd、Guad、Cyt、Thym濃度分別為297.6、188.6、191.8、402.2、314.2、582.6、154.0、296.0、200.4、243.8、346.0、206.8 μg/mL的混合對照品儲備液,上述儲備液稀釋制成不同濃度的對照品溶液。

2.3 色譜條件

參照文獻方法[12]:ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相A為5 mmol/L甲酸銨、5 mmol/L乙酸銨和0.2%的甲酸水溶液,流動相B為1 mmol/L甲酸銨、1 mmol/L乙酸銨和0.2%的甲酸乙腈溶液;梯度洗脫(0～3 min,10%A;3～9 min,10%→18%A;9～15 min,18%→20%A;15～16 min,20%→46%A;16～18 min,46%A);流速0.4 mL/min;柱溫20 ℃,進樣體積1 μL。

2.4 質譜條件

多反應檢測(MRM),電噴霧離子源采用正離子模式(ESI+),毛細管電壓:3.0 kV,離子源溫度150 ℃,脫溶劑氣溫度550 ℃,脫溶劑氣流量1 000 L/h;錐孔氣流量50 L/h;碰撞氣流量0.15 mL/min,所測成分錐孔電壓和碰撞能力與MRM匹配。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系、檢出限和定量限

取“2.2項”下不同濃度的混合對照品溶液,按2.3項色譜條件進行測定,以各對照品離子流峰面積(y)與其濃度(μg/mL,x)繪制標準曲線,得線性回歸方程和相關系數r。檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分別以信噪比(S/N)為3和10計算。結果見表1,LOD和LOQ分別為1.18～9.96 ng/mL和3.82～28.98 ng/mL,可以用于定量分析。

表1 方法學考察

2.5.2 精密度、重復性、穩定性試驗

精密度試驗:取同一混合對照品溶液,按“2.3項”色譜條件和“2.4項”質譜條件連續進樣6次,測定各成分峰面積,計算相對標準偏差(RSD)。結果見表2,12種核苷、堿基峰面積的RSD值均<5.0%,表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取供試樣品寧夏產6號樣本,按“2.1項”平行制備供試品溶液6份,按“2.3項”色譜條件和“2.4項”質譜條件測定峰面積,計算各測定成分峰面積的RSD。結果見表2,表明該方法重復性良好。

穩定性試驗:取供試樣品寧夏產6號樣本,按“2.1項”制備供試品溶液,按“2.3項”和“2.4項”條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定峰面積,計算峰面積RSD值。結果見表2,表明供試品樣品在24 h內穩定。

2.5.3 加樣回收率試驗

取已知各成分含量的樣品寧夏產6號樣本約0.5 g,精密稱定,根據樣品中各成分含量的80%、100%和120%分別加入對照品,按“2.1項”制備供試品溶液,按“2.3項”色譜條件和“2.4項”質譜條件測定峰面積,計算回收率。結果見表2,回收率在94.32%～103.9%,RSD值<5.0%,表明該方法準確度良好。

2.6 不同產地甘草中核苷和堿基含量測定

本研究共測定了12種核苷、堿基類成分,其中包括5種核苷(Thym、2′-dC、Uri、Cytd、Guad)、6種堿基(Gua、Ade、Hyp、Xan、Cyt和Thym)和1種核苷酸(C-5′P),色譜圖見圖1,含量測定結果見圖2,不同產地甘草中核苷和堿基含量差異采用Duncan′s多重比較分析。測定樣品的核苷、堿基類總含量為31.84～38.17 mg/100 g,不同產地甘草中核苷、堿基類總含量寧夏>甘肅>內蒙古>新疆,寧夏與甘肅產甘草中核苷、堿基類成分總含量顯著高于內蒙古和新疆產甘草(P<0.05)。分析各核苷、堿基類成分含量,結果顯示:(1)甘草中核苷類成分以Cytd最高,Guad次之,二者的含量分別為5.001～11.185 8 mg/100 g和2.014～8.824 8 mg/100 g,二者含量占核苷、堿基類總含量的26.2%～47.8%;Thyd和2′-dC的含量相對較低,其中Thyd的含量低于0.5 mg/100 g、2′-dC的含量低于1 mg/100 g。比較不同產地甘草之間核苷類成分含量差異,五種核苷類成分在不同產地甘草中含量存在顯著差異(P<0.05),均呈現為甘肅最高,其中Cydt、Guad和Uri在不同產地甘草中的含量變化趨勢基本一致,內蒙古和新疆產甘草中的含量顯著低于甘肅和寧夏(P<0.05)。(2)甘草中堿基類成分以Ade和Gua含量較高,含量分別為2.003～7.595 5 mg/100 g和2.554 4～7.737 0 mg/100 g,二者含量占核苷、堿基類總含量的19.3%～38.7%;其余四種堿基的含量均低于1 mg/100 g。比較不同產地甘草之間堿基類成分含量差異,六種堿基的含量均存在顯著差異(P<0.05),但不同產地間含量變化趨勢不同。其中Gua、Hyp和Xan均以寧夏和內蒙古產甘草中含量較高,Gua和Xan以甘肅顯著低于其他產區(P<0.05),Xan含量在甘肅和新疆產甘草中無顯著差異(P>0.05);Ade含量新疆>甘肅≈寧夏>內蒙古;Cyt在內蒙古產甘草中的含量顯著高于寧夏和甘肅(P<0.05);Thym以內蒙古產甘草中含量最高,其他三個產區無顯著差異(P>0.05)。綜合考慮堿基類成分,寧夏和內蒙古產甘草中含量較高。(3)研究中僅檢測到了C-5′P一種核苷酸,其含量為2.349 7～9.856 9 mg/100 g,占總核苷、堿基含量的6.1%～28.2%。各產地甘草中C-5′P的含量為新疆>甘肅>寧夏>內蒙古,其中新疆與內蒙古產甘草中含量差異顯著(P<0.05)。綜上可知,不同產地甘草中核苷、堿基類成分含量變化并不一致,評價其質量差異需綜合考慮各成分含量變化及占比。

圖1 核苷和堿基類UPLC-TQ/MS色譜圖

圖2 不同產地甘草中核苷、堿基含量

2.7 PCA和PLS-DA分析

為分析不同產地甘草中核苷、堿基類成分特征,基于測定12種核苷、堿基含量,對153批次甘草進行主成分分析(PCA),結果顯示,前兩個主成分(PC1和PC2)累計貢獻率達54.8%,各產地甘草樣本間形成了聚類趨勢,但不能將各產地樣本明確區分(見圖3A)。為進一步確定各產地樣本間是否存在差異,對153批甘草樣本進行偏最小二乘(PLS-DA)判別分析,模型結果顯示,R2Y為0.53,Q2為0.501,均大于0.5,代表模型準確率較高,PLS-DA判別結果見圖3B。由圖可知,不同產地的甘草可以分為兩組,第一組(Ⅰ)產自寧夏和內蒙古,第二組(Ⅱ)產自甘肅和新疆。VIP圖分析結果顯示(見圖3C),Gua、Ade、Uri、Cytd和Guad的VIP>1,為不同產地甘草中主要差異的核苷和堿基類成分。

圖3 不同產地甘草中核苷、堿基類成分PCA和PLS-DA分析

PLS-DA判別分析將不同產地甘草區分為兩組,其中寧夏和內蒙古產區地理位置接近,被劃分為了同一組;而甘肅主產區和新疆產區地理位置則較為接近,被劃分為另外一組。為進一步判定各組內不同產地之間甘草中核苷、堿基類成分特征,再次采用PLS-DA分別分析組Ⅰ和組Ⅱ中甘草樣本,結果見圖4。PLS-DA分析甘肅和新疆樣本,判別模型顯示R2Y和Q2分別為0.948和0.939,接近于1,表明模型準確率高,得分圖顯示(見圖4A),二者可以完全區分。雙坐標(Biplot)圖(見圖4B)顯示,Ade、C-5′P、Xan、Gua和Cyt與新疆樣本的相關性較高,而Thyd、Thym、Hyp、2′-dC、Guad、Cytd和Uri則與甘肅樣本的相關性較高。進一步采用VIP圖分析二者主要的差異成分顯示(見圖4C),Uri、Cytd、Guad和Ade的VIP值>1,為主要差異成分。寧夏和內蒙古樣本的PLS-DA分析結果顯示,判別模型的R2Y和Q2分別為0.565和0.454,Q2<0.5,模型相對較差。同時得分圖顯示(見圖4D),基于核苷和堿基類成分,PLS-DA并不能完全區分寧夏和內蒙古樣本,表明兩個產地的核苷、堿基類成分含量一致度較高,樣本較為相似。

圖4 不同組內甘草中核苷、堿基類成分PLS-DA分析

3 討論與結論

中藥材質量是保障臨床用藥安全和有效的基礎,除遺傳因素外,環境和人為等因素均可引起質量差異。道地藥材形成逆境效應理論[13]的提出表明了環境脅迫對藥材質量的影響。藥材產地不同,其所受的環境因素不同,進而影響其質量,如已有研究表明,不同產地半邊蓮[14]、陳皮[15]、白芍[16]等藥材質量存在差異。課題組前期研究結果表明,不同產地甘草中黃酮、三萜類等次生代謝產物存在差異[7]。然而,目前對不同產地藥材的質量差異的研究多側重于次生代謝物,對于其初生代謝產物,如氨基酸、核苷、堿基等成分的研究報道較少。本研究基于甘草中初生代謝物核苷、堿基類研究不同產地甘草質量差異,研究結果顯示,不同產地甘草中核苷、堿基類成分含量為31.84～37.83 mg/100 g,與枸杞子[17]中的含量相近,低于菊花中核苷、堿基的總含量(61.13～555.45 mg/100 g)[18],但高于茯苓中核苷、堿基類成分的總含量(6.23～10.28 mg/100 g)[19],由此可見,甘草中核苷、堿基類成分含量在藥食同源中藥材中處于中等水平。基于四個產地樣本的PLS-DA判別結果顯示,寧夏和內蒙古樣本聚為一類,甘肅和新疆樣本聚為另外一類,分析其可能原因,甘草產地經歷了從甘肅等地到寧夏、內蒙古等地的變遷[20],且從地理位置判斷,甘草在甘肅和新疆的主產區的地理位置較為接近,而內蒙古和寧夏地理位置較為接近,地理位置相近的產區環境因子、生產加工等均較為相似,進而促進了藥材質量特征的一致性。進一步的PLS-DA判別分析結果顯示,甘肅和新疆樣本可以區分,其可能原因是二者的主產區雖都屬于大陸性氣候,但在地形地貌、無霜期等方面依然存在差異,進而導致了藥材中化學成分的積累差異。不同產地間主要的差異成分為Gua、Ade、Uri、Cytd和Guad,其中Gua可以通過控制基因轉錄作為一種連接生長和細胞能量狀態的因子[21];Ade在免疫和炎癥反應中發揮著重要作用[22];Uri和Guad作為中樞神經系統的調節分子,可以調節大腦中的不同生理和病理過程[23];由此可知,以上差異性成分具有一定的生理、藥理活性,其成分含量差異可能導致活性差異,進而影響其高效、合理利用。

本研究采用UPLC-TQ/MS測定了不同產地甘草中12種核苷、堿基類成分含量。研究結果顯示,不同產地甘草中核苷、堿基類總含量存在顯著差異(P<0.05),且基于測定的核苷、堿基含量,采用PLS-DA判別分析可以將甘草樣本進行產地劃分,其中寧夏和內蒙古產的甘草中核苷、堿基類成分最為相似,各產地間主要的差異成分為Gua、Ade、Uri、Cytd和Guad。研究結果為揭示不同產地甘草質量存在差異提供了理論支持,為其合理開發利用奠定了基礎。