不同栽培品種柑橘橘皮黃酮類成分含量及抗氧化活性比較研究

王海帆,王 鵬,王 福,陳 林,陳鴻平,胡 媛,劉友平

成都中醫藥大學藥學院 西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都 611137

柑橘在我國已有四千多年栽培歷史,宋代柑橘已有幾十個品種,《橘錄》載:“柑品有八,有朱柑、乳柑……;橘品十有四,有黃橘、朱橘……”。近年來為追求柑橘果肉的食用價值及經濟效益,又出現了大量橘栽培新品種,如甘平、青見、明日見等[1]。可見柑橘從古至今均有多品種的特點,其果皮入藥也亦有記載。《神農本草經》[2]中首次記載了陳皮來源為蕓香科柑橘屬寬皮橘類多種栽培品種的果皮。2020年版《中國藥典》一部陳皮項下[3]規定陳皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。特別注明了4種柑橘入藥品種,茶枝柑C.reticulata‘Chachi’(廣陳皮)、大紅袍C.reticulata‘Dahongpao’、溫州蜜柑C.reticulata‘Unshiu’、福橘C.reticulata‘Tangerina’。可見柑橘雖有多個品種,但其果皮藥用價值有所不同。2002年,衛生部頒布“衛生部關于進一步規范保健食品原料管理的通知衛法監發[2002]51號”,印發新的“既是食品又是藥品的物品名單”中規定橘皮為食藥兩用物質[4]。如今柑橘皮作為藥食兩用物質,不僅僅面臨品種選擇問題。隨著柑橘種植面積加大,柑橘加工業興起所產生副產品果皮,有些以“雜陳皮”[5]流通于市場,有些作為廢棄物掩埋。不同柑橘果皮的應用價值研究滯后,導致其應用現狀混亂,其藥食兩用價值利用不合理,不充分問題突出。

2020年版《中國藥典》一部陳皮項下[3]對于陳皮藥材的質量控制,只規定了橙皮苷含量限度,有一定局限性。黃酮類化合物作為柑橘橘皮中主要活性成分之一,具有改善糖脂代謝、保護心血管、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[6]。羅美霞[7]等研究就表明以橙皮苷和多甲氧基黃酮中含量較高且差異較大的川陳皮素和橘皮素為多指標成分進行陳皮質量綜合評價更科學、全面,且川陳皮素和橘皮素具有預防肥胖、輔助降血脂、抗炎的作用[8,9]。雖已有研究表明不同品種柑橘皮黃酮含量有明顯差異[10],但并未與2020年版《中國藥典》陳皮項下規定的入藥品種做對比。故本研究以9種柑橘果皮為研究對象,測定總黃酮,化學性質比較穩定、便于提取分離、含量較高且生物活性明確的5種黃酮類成分(蕓香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素及橘皮素)及抗氧化活性并進行聚類分析及TOPSIS分析,以期為橘皮藥食兩用價值評價提供一定參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津公司);U-T1800型雙光束紫外可見分光光度計(上海屹譜儀器制造有限公司);CP2000型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司);Varioskan flash型酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司);UPTUO-I-1000TE優普系列超純水機(成都純水科技有限公司)。

1.2 材料

橙皮苷(批號:wkq22010509,純度:98%)、甜橙黃酮(批號:wkq22051711,純度:98%)(成都埃法生物科技有限公司);蕓香柚皮苷(批號:RFS-Y07102206023,純度:98%)、橘皮素(批號:MUST-21083014,純度:98%)、川陳皮素(批號:MUST-20041210,純度:98%)(成都曼思特生物科技有限公司);甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,美國TEDIA天地試劑公司);95%乙醇(分析純,成都臨江化工廠);甲醇(分析純,成都市科隆化學品有限公司)。

樣品均經成都中醫藥大學藥學院藥用植物學教研室嚴鑄云教授鑒定為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)栽培品種的干燥成熟果皮(見表1)。

表1 樣品信息表

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液制備

精密稱取橙皮苷對照品0.10 mg,加甲醇制成1 mL 0.10 mg的溶液作為對照品儲備液[11]。

2.1.2 供試品溶液制備

將橘皮樣品粉碎,過4號篩,稱取橘皮樣品粉末約0.5 g,置具塞錐形瓶中,精密量取甲醇30 mL,稱重,超聲提取30 min,稱重,用甲醇補足重量,過濾,收集濾液,甲醇定容至50 mL即得[11]。

2.1.3 標準曲線的繪制

精密稱取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶,以甲醇為空白,在285.5 nm處測定吸光度,以吸光度(Y)為縱坐標,濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線,得到線性回歸方程[11]:Y=47.029X-0.0497,R2=0.9996,在0.008～0.0 016 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 樣品中總黃酮的含量測定

取不同品種柑橘橘皮,按“2.1.2”項下,制備溶液,在285.5 nm處測定吸光度,根據線性回歸方程計算不同品種柑橘橘皮中總黃酮含量,結果見表2。總黃酮含量范圍為34.8～69.3 mg/g,不同品種之間,DHP和CLU總黃酮含量顯著高于AY38、CJ、WG、GP(P< 0.05)。

表2 不同栽培品種柑橘橘皮總黃酮含量測定

2.2 主要活性成分含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取蕓香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素和橘皮素對照品適量,置5 mL容量瓶中,加甲醇溶解定容,混勻,得到濃度分別為0.264、0.57、0.066、0.126、0.08 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取不同品種橘皮樣品粉末(過4號篩)約0.5 g,精密稱定,加30 mL 70%甲醇,超聲(500 W,30 kHz)30 min,放冷,稱重,用70% 甲醇補重,過濾,取續濾液過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.2.3 色譜條件

采用Boston Green ODS C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動相:0.1%甲酸溶液為流動相A,乙腈溶液為流動相B,梯度洗脫(0～10 min,20%→30%B;10～20min,30%→50% B;20～30min,50%→60% B;30～35min,60%→90% B;35～40min,90%→100% B,40～50 min,100%→20% B);流速為0.7 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為332 nm;進樣量為10 μL;檢測器為紫外(DAD)檢測器[12]。混合對照品溶液及橘皮樣品溶液的HPLC色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液(A)及樣品溶液(B)HPLC色譜圖

2.2.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL,分別進樣,記錄HPLC色譜圖。

以進樣量(x,μL)為橫坐標,以峰面積(y)為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程,結果見表3。

表3 不同栽培品種柑橘橘皮中主要活性成分線性回歸方程及線性范圍

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 精密度試驗

在 “2.2.3” 色譜條件下,對同一對照品溶液重復6次進樣,進樣量10 μL,計算蕓香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素峰面積的RSD值分別為0.13%、0.45%、2.5%、0.19%、0.37%,表明儀器精密度良好。

2.2.5.2 重復性試驗

取同一批橘皮6份,制備成供試品溶液,在“2.2.3”色譜條件下進樣,計算蕓香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素峰面積的RSD值分別為1.5%、1.0%、0.53%、0.19%、1.0%,表明方法重復性良好。

2.2.5.3 穩定性試驗

取橘皮供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h,按“2.2.3”色譜條件下進樣,計算蕓香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素和橘皮素峰面積的RSD值分別為2.2%、1.7%、2.2%、3.7%、0.050%,表明蕓香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素和橘皮素在24 h內穩定性良好。

2.2.5.4 回收率試驗

取一批橘皮樣品6份,精密稱定,加入適量對照品溶液,按“2.2.2”項方法制備供試品溶液,按 “2.2.3” 項下色譜條件進樣測定并計算蕓香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素和橘皮素平均回收率分別為102.3%、97.49%、98.43%、97.66%、98.37%,RSD值分別為1.1%、2.5%、2.3%、2.5%、1.7%。

2.2.5.5 樣品含量測定

取不同品種橘皮樣品,按 “2.2.2” 項下制備樣品溶液,按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定,根據外標一點法計算不同品種橘皮中5種黃酮類成分含量,結果見表4。

表4 不同栽培品種柑橘橘皮黃酮類成分含量

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 供試品溶液的制備

按照 “2.2.2” 項下的方式制備供試品原液,再分別稀釋6倍及8倍。

2.3.2 DPPH溶液的配制

精密稱取DPPH 2.02 mg,置于50 mL容量瓶中,加95%乙醇溶解,定容,搖勻,即得DPPH溶液(濃度為0.040 4 mg/mL)。

2.3.3 ABTS溶液的配制

將ABTS配制成6.94 mmol/L水溶液,將K2S2O8配制成2.6 mmol/L水溶液,在使用前將二者混合溶液置于陰涼處12～16 h,使兩者發生完全充分的反應。然后用95%乙醇稀釋原溶液,在波長734 nm處檢測,直到最終測得的吸光度值在0.70±0.02之間,即完成ABTS+溶液的配制[13]。

2.3.4 DPPH清除率計算

96孔板加入樣品后置于陰暗處反應1 h后使用Varioskan Flash酶標儀測定OD值,測定波長選擇517 nm。DPPH清除率計算公式如下。

式中:A0表示100 μL DPPH溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值;A1表示100 μL DPPH溶液+100 μL供試品;A2表示100 μL供試品溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值。

由表4可知,不同栽培品種柑橘橘皮醇提取物對DPPH自由基清除能力具有一定差異。其中,CJ對DPPH自由基的清除能力最高,CLU對DPPH自由基的清除能力最低。

2.3.5 ABTS清除率計算

96孔板加入樣品后置于陰暗處反應40 min后使用Varioskan Flash酶標儀測定吸光度OD值,測定波長選擇750 nm。ABTS清除率計算公式如下。

式中:A0表示25 μL 95%乙醇+175 μL ABTS+的吸光度值;A1表示25 μL樣品+175 μL ABTS+的吸光度值;A2表示25μL樣品175 μL 95%乙醇的吸光度值。

由圖2可知,不同栽培品種柑橘橘皮醇提取物對DPPH自由基清除能力具有一定差異。其中,CJ對DPPH自由基清除能力最高,CLU對ABTS自由基的清除能力最高。

2.4 多元統計法分析不同栽培品種橘皮的質量差異

2.4.1 聚類分析

將上述8個指標經歸一化處理后作為評價指標,采用邁維云平臺(https://cloud.metware.cn/#/home)繪制聚類熱圖,詳見圖3。結果顯示,9種樣品可以劃分為3類:DHP、PK、AY38為第Ⅰ類,該類樣品中以川陳皮素和橘皮素的含量相對較高;CLU、CJ、WG為第Ⅱ類,該類樣品中以蕓香柚皮苷的含量相對較高;CJ、GP、MRJ為第Ⅲ類,該類樣品中化合物含量及抗氧化能力相對較弱;對比各類樣品的熱圖顏色深淺,發現第Ⅰ類樣品相對Ⅱ、Ⅲ類樣品顏色更紅,表明第Ⅰ類樣品的綜合質量相對較好。

圖3 不同栽培品種柑橘橘皮8個指標聚類熱圖

2.4.2 熵權TOPSIS分析

以不同栽培品種柑橘橘皮中8個指標的數據為原始數據,建立初始決策矩陣,計算出每個指標的權重系數,選出最優方案與最劣方案,然后計算每個樣品與最優解的歐氏貼近度Ci 并進行排序[14,15]。結果顯示,樣品 DHP、PK、AY38的綜合得分較高(分別為0.663、0.600、0.540),而CJ、MRJ和GP的綜合得分較低(分別為0.307、0.220和0.198),這提示樣品DHP、PK、AY38的綜合質量相對較好,CJ、MRJ和GP的綜合質量相對較差,該結果與聚類分析結果基本一致。結果見表5。

表5 不同栽培品種柑橘橘皮綜合質量評分排序結果

3 討論與結論

大紅袍紅橘(DHP)總黃酮含量及抗氧化能力與溫州蜜柑(CLU)、椪柑(PK)、青見(QJ)及明日見(MRJ)差異不顯著,其中CLU及QJ橙皮苷含量顯著高于DHP。在食品工業中,柑橘果皮憑借其強抗氧化性而被應用于各個方面,例如橘皮提取物可作為豬肉天然保鮮劑[16],可作為具抗氧化性的柑橘果凍功能食品[17]。未作藥用的CLU、PK、QJ及MRJ均可作為天然抗氧化劑提取來源。黃酮類化合物中橙皮苷含量超過黃酮含量的50%,并且具有抗炎、抗氧化、抑菌、調控脂質代謝等生理功能[18],且單體是應用于對抗SARS-CoV2病毒最有效的抗菌劑[19],也有制成橙皮苷透皮納米制劑治療普通假單胞菌[20]及橙皮苷納米顆粒處理環境有機污染物[21]。實驗結果表明CLU及QJ可為提取橙皮苷提供原材料。

聚類熱圖分析通過對復雜數據進行篩選、提取和降維,可快速、全面地對樣品進行鑒別和歸類,并將結果直觀地展現出來[22]。熵權TOPSIS法是一種多指標的決策分析方法,現已被廣泛用于中藥材的質量評價中[23]。將這2種方法結合起來應用,可更加科學、全面、客觀地評價藥材質量。聚類熱圖分析結果顯示,9種橘皮被劃分為3類,并且第Ⅰ類樣品(DHP、PK、AY38)的質量優于第Ⅱ～Ⅲ類樣品。同時,本研究以熵權TOPSIS 法建立了陳皮藥材的整體質量評價模型,結果顯示,樣品 DHP、PK的綜合得分排序在前2位,提示其質量相對較好。上述分析方法相互結合、互為補充,分析結果相互印證,能較全面地評價陳皮藥材的質量。結合總黃酮含量測定結果:大紅袍紅橘(DHP)總黃酮含量顯著高于愛媛38號(AY38)、春見(CJ)、沃柑(WG)及甘平(GP)(P< 0.05),最終得出PK與DHP黃酮類化學成分及抗氧化活性相接近,有作為藥用栽培品種的潛力,與文獻研究結果一致[5]。

綜上,本研究對9種橘皮黃酮類化學成分及抗氧化活性進行比較分析,發現DHP、CLU、PK、QJ及MRJ均可作為天然抗氧化劑提取來源,CLU及QJ可為橙皮苷化合物提取提供原料,為柑橘果皮副產物產品開發提供參考。9個不同栽培品種橘皮中PK與DHP黃酮類化學成分及抗氧化活性接近,有作為藥用栽培品種的潛力,為目前不同栽培品種橘皮混雜入藥提供參考。但本研究只重點測定了9種栽培品種橘皮中黃酮類指標成分的含量,成分類別和樣品批次相對較少。在后續研究中,可增加樣品批次,并綜合生物堿類、多糖類及揮發油類等多個類別的成分進行分析,以更加全面地評價橘皮的藥食兩用價值。