地卷柏的化學成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

姜紅宇,呂敬崑,邵金華,陳小明,*

1湖南科技學院化學與生物工程學院;2湖南省銀杏工程技術研究中心;3湖南恒偉藥業(yè)股份有限公司,永州 425100

地卷柏(SelaginellaprostrataH.S.Kung)系卷柏科卷柏屬多年生草本植物,常生于海拔1 500～2 500 m的石縫中或林下苔蘚石上,在貴州、云南和四川等省份均有分布。地卷柏全草可供藥用,將其烘干或燒成炭后研末與茶油調(diào)和,外敷可用于止血;燉酒內(nèi)服,可治損傷、閉經(jīng)血瘀等癥。此外,地卷柏還具有較高的觀賞價值,可供栽培觀賞[1,2]。

卷柏屬植物種類繁多、資源豐富,全世界約有700種,主產(chǎn)于熱帶地區(qū)。其中,我國約有70余種,且廣泛分布于全國各地,兗州卷柏、江南卷柏等20余種植物作為民間傳統(tǒng)用藥已被廣泛應用[3-5]。作為官方用藥的有卷柏和墊狀卷柏,兩者均被收錄于2020年版《中華人民共和國藥典》,具有化瘀止血、活血通經(jīng)的功效,可用于跌撲損傷、經(jīng)閉痛經(jīng)、吐血以及崩漏等疾病的治療[6-8]?，F(xiàn)代研究表明,卷柏屬植物含有黃酮類、木脂素類、炔酚類和萜類等多種化學成分,具有降血糖、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎以及抗菌等作用[9-14]。目前,國內(nèi)外對卷柏屬植物的研究主要集中在卷柏、中華卷柏和江南卷柏等幾種植物上,對該屬其他植物的研究較少[15,16]。地卷柏隸屬卷柏屬植物,迄今為止有關其化學成分以及藥理活性的研究尚未見有文獻報道。為了進一步闡明和發(fā)掘地卷柏的藥用價值和活性物質(zhì)基礎,本文對地卷柏的95%乙醇提取物進行化學成分研究,并對分離獲得的化合物進行體外酶抑制活性評價,以期為地卷柏植物資源的合理開發(fā)利用奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Bruker 400 MHz和600 MHz核磁共振譜儀(德國Bruker公司);Agilent 6545 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀,Cary 3500紫外可見分光光度計(美國安捷倫公司);Tensor 37傅里葉變換紅外光譜儀(布魯克光譜儀器公司);ELX-800酶標儀(美國寶特公司);依利特P3700半制備液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司);200～300目柱層析硅膠及硅膠GF254薄層板(青島海洋化工有限公司);RP-18反相柱色譜硅膠和YMC-Pack Pro C18色譜柱:5 μm,250 mm × 10 mm(日本YMC公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(德國Merck公司);色譜乙腈、甲醇(美國Tedia公司);水為實驗室自制超純水;二氯甲烷、甲醇等分析純試劑均為西隴化工股份有限公司產(chǎn)品;α-葡萄糖苷酶(美國Sigma公司,批號:SLBT8587)、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(純度≥98.0%,上海源葉生物科技有限公司,批號K22J9B64113);阿卡波糖(純度≥98.0%,上海源葉生物科技有限公司,批號S25M11X109783)。

1.2 植物材料

地卷柏于2021年7月在中國云南省彝良縣采集,經(jīng)湖南科技學院姜紅宇副教授鑒定為卷柏科卷柏屬植物地卷柏(SelaginellaprostrataH.S.Kung)的全草,植物樣品標本(2021-PS-0701)存放于湖南省銀杏工程技術研究中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取與分離

取地卷柏的干燥全草10 kg,粉碎后用95%乙醇加熱回流提取3次,每次3 h,合并提取液濃縮得到粗浸膏1.2 kg。粗浸膏用水混懸后,依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取,濃縮萃取液分別得到二氯甲烷部位148 g、乙酸乙酯部位426 g、正丁醇部位220 g和水部位406 g。

乙酸乙酯萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜分離,二氯甲烷:甲醇(100∶1→5∶1)梯度洗脫,得到9個流分(E1～E9)。其中,流分E3經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇)分離,得到6個亞流分E3.1～E3.6。亞流分E3.3經(jīng)薄層制備和半制備型HPLC(甲醇:水,30:70,2 mL/min)分離得到化合物1(tR=36.2 min,10.4 mg)和4(tR=9.9 min,6.7 mg)。亞流分E3.4經(jīng)硅膠柱分離,二氯甲烷:甲醇(80∶1→3∶1)梯度洗脫得到化合物2(8.0 mg)和3(4.5 mg)。流分E4經(jīng)ODS柱分離,甲醇:水(20∶80→100∶0)梯度洗脫,得到7個亞流分E4.1～E4.7。亞流分E4.2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇)得到化合物7(10.3 mg)。亞流分E4.3經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇)和半制備HPLC(乙腈∶水,25∶75,2 mL/min)分離得到化合物5(tR=37.3 min,15.7 mg)和6(tR=45.8 min,9.2 mg)。流分E6經(jīng)反復硅膠柱色譜和凝膠柱色譜等手段分離純化,得到化合物8(19.8 mg)、9(24.6 mg)和10(15.9 mg)。

1.3.2α-葡萄糖苷酶體外抑制活性測試

參照文獻方法[17],以阿卡波糖為陽性對照,準確依次移取50 μL的磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)、20 μL不同濃度的待測樣品溶液(終質(zhì)量濃度為0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL)、10 μL的α-葡萄糖苷酶溶液(1 U/mL)和20 μL對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液(2.5 mmol/L)置于96孔板中,并在37 ℃條件下孵育15 min,然后加入150 μL的Na2CO3溶液終止反應。用酶標儀在405 nm處測定吸光度(A),設定樣品組和空白組,平行操作3次,取平均值。按公式計算抑制率:抑制率=[1-(A樣品-A樣品空白)/A空白]×100%。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1無色油狀液體;(+)-HR-EI-MS:m/z275.161 8[M+Na]+(calcd for C15H24O3Na,275.161 8),確定其分子式為C15H24O3,不飽和度為4;IR(KBr)νmax3 342、2 931、2 875、1 626、1 568、1 412、1 332、1 131、1 045、1 015、886 cm-1,上述特征吸收峰提示化合物結構中可能存在羥基和碳碳雙鍵官能團;化合物1的1H NMR譜(見表1)顯示存在2個烯氫信號δH5.65(1H,m)、5.32(1H,br s),2個連氧次甲基信號δH5.12(1H,br s)、3.96(1H,m),1個連氧亞甲基信號δH4.15(1H,br s)、4.13(1H,br s),2個亞甲基信號δH2.21(1H,ddd,J=12.4,4.4,2.0 Hz)、1.84(1H,ddd,J=12.4,4.4,2.0 Hz)、1.54(1H,overlapped)、1.21(1H,overlapped)和4個甲基信號δH1.59(3H,s)、1.44(3H,s)、1.21(3H,s)、1.15(3H,s);13C NMR譜(見表1)顯示該化合物共有15個碳信號,結合DEPT 135和HSQC譜可歸屬為4個烯烴碳信號(δC154.4、138.3、128.0、121.2),2個連氧次甲基碳信號(δC89.5、66.2),3個亞甲基碳信號(δC59.3、51.0、50.8),4個甲基碳信號(δC31.2、27.5、27.3、12.0)和2個季碳信號(δC89.3、34.2),上述數(shù)據(jù)表明化合物1可能為倍半萜類化合物。通過比較核磁數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),化合物1和文獻[18,19]報道的已知倍半萜類化合物(3S,5R,8S)-5,8-epoxy-6-megastigmadien-3,9-diol具有相似的母核結構,兩者結構上的主要差異在于C-8位所連的側鏈基團不同。采用2D NMR實驗對化合物1的結構進行確證,在1H-1H COSY譜中H-3/H-2、H-3/H-4、H-7/H-8、H-10/H-11之間的相關信號表明存在CH2-CH-CH2、CH-CH、CH-CH2結構單元(見圖1)。

表1 化合物1的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(400和100 MHz,CD3OD)

圖1 化合物1的主要1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關

結合HMBC譜中H-11、H3-12與C-9、C-10相關;H-7與C-1、C-6相關;H-8與C-7、C-9、C-10、C-12、C-15等相關信號可以確定化合物1的平面結構,其主要的2D NMR相關信號如圖1所示?；衔?的相對構型是通過NOESY譜來確定的,H3-13/H-3、H-3/H3-15、H3-15/H-8之間的NOESY相關信號表明H-3、H-8、Me-13和Me-15位于環(huán)系的同側,將其定為β構型(見圖1)。由于在NOESY譜中未觀察到H3-12與H-10之間明顯的相關信號,可以確定C9處的碳碳雙鍵構型為E。Uehelhart等[20]曾報道:該類型倍半萜C-8位的立體構型為R時,在ECD譜中于210 nm左右可以觀察到明顯的正Cotton效應,反之當C-8的立體構型為S時,于210 nm左右可以觀察到明顯的負Cotton效應。在化合物1的實測圓二色譜圖中(見圖2),于208 nm處觀察到正的Cotton效應,因此初步確定C-8的立體構型為R。為了進一步確定化合物1的絕對構型,采用GAUSSIAN 09程序在B3LYP/6-311 G(d,p)基組水平上使用TD-DFT方法對該化合物的ECD光譜進行了計算。通過比較發(fā)現(xiàn),化合物1的實驗ECD光譜與3R,5R,8R構型的計算ECD光譜吻合(見圖2),由此確定化合物1的絕對構型為3R,5R,8R。經(jīng)SciFinder檢索,確定化合物1為新的倍半萜類化合物(見圖3),并將其命名為seprostrataoid A。化合物1的詳細結構鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1的實驗和計算ECD譜圖

圖3 化合物1～10的化學結構

化合物2無色油狀物;HR-EI-MS:m/z227.165 0[M+H]+(calcd for C13H23O3,227.164 2);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:5.75(1H,s,H-7),4.75(1H,br d,J=7.2 Hz,H-8),4.50(1H,m,H-3),3.92(1H,m,H-9),2.60(1H,br d,J=14.0 Hz,H-4b),2.04(1H,br d,J=14.0 Hz,H-2b),1.99(1H,dd,J=13.6,3.2 Hz,H-4a),1.93(3H,s,H-13),1.50(1H,dd,J=13.6,3.2 Hz,H-2a),1.42(3H,d,J=6.6 Hz,H-10),1.40(3H,s,H-11),1.12(3H,s,H-12);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:34.2(C-1),51.1(C-2),66.4(C-3),51.0(C-4),89.4(C-5),154.5(C-6),119.8(C-7),88.4(C-8),71.2(C-9),19.0(C-10),27.5(C-11),31.2(C-12),27.4(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18,19]報道基本一致,故鑒定化合物2為(3S,5R,8S)-5,8-epoxy-6-megastigmadien-3,9-diol。

化合物3白色粉末;HR-EI-MS:m/z197.116 9[M+H]+(calcd for C11H17O3,197.117 2);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:5.74(1H,s,H-7),4.22(1H,m,H-3),2.44(1H,ddd,J=13.2,2.8,2.4 Hz,H-4b),1.96(1H,ddd,J=14.4,2.8,2.4 Hz,H-2b),1.78(3H,s,H-11),1.76(1H,dd,J=13.2,4.0 Hz,H-4a),1.55(1H,dd,J=14.4,3.6 Hz,H-2a),1.46(3H,s,H-10),1.32(3H,s,H-9);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:37.4(C-1),48.0(C-2),67.5(C-3),46.5(C-4),89.2(C-5),185.9(C-6),113.7(C-7),174.5(C-8),31.5(C-9),27.0(C-10),27.4(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致,故鑒定化合物3為(-)-黑麥草內(nèi)酯。

化合物4白色粉末;HR-EI-MS:m/z243.159 9[M+H]+(calcd for C13H23O4,243.159 1);1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.40(1H,d,J=16.2 Hz,H-7),6.38(1H,d,J=16.2 Hz,H-8),4.09(1H,m,H-3),2.30(3H,s,H-10),1.80(1H,m,H-4β),1.72(1H,m,H-4α),1.68(1H,t,J=12.0 Hz,H-2β),1.25(3H,s,H-11),1.12(1H,m,H-2α),1.12(3H,s,H-13),0.85(3H,s,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:41.2(C-1),46.2(C-2),65.0(C-3),45.5(C-4),77.7(C-5),80.0(C-6),132.2(C-7),152.8(C-8),201.2(C-9),26.4(C-10),27.5(C-11),26.9(C-12),27.2(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道基本一致,故鑒定化合物4為(3S,5R,6R,7E)-3,5,6-三羥基-7-巨豆烯-9-酮。

化合物5白色粉末;HR-EI-MS:m/z347.113 8[M+H]+(calcd for C18H19O7,347.112 5);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.65(1H,br s,H-6′),7.57(1H,br s,H-2′),6.98(1H,br s,H-2),6.86(1H,br s,H-6),6.79(1H,br s,H-5),5.62(1H,d,J= 6.0 Hz,H-7),3.90(3H,s,3′-OCH3),3.82(2H,m,H-9),3.81(3H,s,3-OCH3),3.58(1H,m,H-8);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:124.1(C-1′),114.0(C-2′),143.9(C-3′),55.3(3′-OCH3),152.5(C-4′),129.0(C-5′),119.5(C-6′),169.0(C-7′),132.8(C-1),109.3(C-2),147.6(C-3),55.0(3-OCH3),146.5(C-4),114.8(C-5),118.5(C-6),88.7(C-7),53.1(C-8),63.3(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23,24]報道基本一致,故鑒定化合物5為(7R,8S)-ceplignan。

化合物6淡黃色油狀物;HR-EI-MS:m/z397.125 8[M+Na]+(calcd for C20H22O7Na,397.125 8);1H NMR(400 MHz,(CD3)2CO)δ:7.62(1H,br s,H-4),7.52(1H,br s,H-6),6.74(2H,s,H-2′,H-6′),5.64(1H,d,J=7.2 Hz,H-2),3.93(2H,m,CH2OH),3.90(3H,s,7-OCH3),3.80(6H,s,3′-OCH3,5′-OCH3),3.66(1H,m,H-3),2.50(3H,s,COCH3);13C NMR(100 MHz,Acetone-d6)δ:89.6(C-2),53.8(C-3),119.6(C-4),130.2(C-5),113.0(C-6),144.8(C-7),153.4(C-8),132.0(C-9),132.2(C-1′),104.2(C-2′,C-6′),148.6(C-3′,C-5′),136.0(C-4′),197.1(COCH3),26.4(COCH3),63.7(CH2OH),56.5(3′-OCH3,5′-OCH3),56.2(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[25]報道基本一致,故鑒定化合物6為(2R,3S)-二氫-2-(3′,5′-二甲氧基-4′-羥基苯基)-3-羥甲基-7-甲氧基-5-乙?；今夁秽?/p>

化合物7淡黃色粉末;HR-EI-MS:m/z441.153 5[M+Na]+(calcd for C22H26O8Na,441.152 0);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.24(2H,d,J=1.8 Hz,H-6,H-6′),7.16(2H,d,J=1.8 Hz,H-2,H-2′),4.75(2H,d,J=4.2 Hz,H-7,H-7′),4.27(2H,dd,J=9.0,7.2 Hz,H-9a,H-9′a),3.98(6H,s,3-OCH3,3′-OCH3),3.92(6H,s,4-OCH3,4′-OCH3),3.88(2H,dd,J=9.0,4.2 Hz,H-9b,H-9′b),3.12(2H,t,J=4.2 Hz,H-8,H-8′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:132.9(C-1,C-1′),103.8(C-2,C-2′),152.5(C-3,C-3′),146.3(C-4,C-4′),149.1(C-5,C-5′),109.1(C-6,C-6′),86.1(C-7,C-7′),54.4(C-8,C-8′),71.9(C-9,C-9′),56.3(3-OCH3,3′-OCH3),61.2(4-OCH3,4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[26]報道基本一致,故鑒定化合物7為5,5′-二甲氧基木香酚 A。

化合物8黃色粉末;HR-EI-MS:m/z539.098 8[M+H]+(calcd for C30H19O10,539.097 3);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.10(1H,d,J=2.4 Hz,H-2′′′),8.05(1H,dd,J=8.4,2.4 Hz,H-6′′′),7.65(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,H-6′),7.25(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′′′),6.86(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),6.76(1H,s,H-3″),6.68(1H,s,H-3),6.57(1H,d,J=2.4 Hz,H-8″),6.48(1H,s,H-6),6.25(1H,d,J=2.4 Hz,H-6″);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:164.2(C-2),103.0(C-3),182.1(C-4),162.9(C-5),99.2(C-6),160.6(C-7),104.5(C-8),160.0(C-9),103.8(C-10),121.5(C-1′),128.4(C-2′,C-6′),115.8(C-3′,C-5′),161.1(C-4′),163.8(C-2″),103.0(C-3″),181.7(C-4″),161.5(C-5″),98.8(C-6″),164.0(C-7″),94.2(C-8″),159.7(C-9″),103.8(C-10″),121.7(C-1′′′),131.3(C-2′′′),121.0(C-3′′′),161.3(C-4′′′),120.4(C-5′′′),128.2(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[27]報道基本一致,故鑒定化合物8為穗花衫雙黃酮。

化合物9土黃色粉末;HR-EI-MS:m/z553.112 2[M+H]+(calcd for C31H21O10,553.112 9);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:13.10(1H,s,5-OH),12.90(1H,s,5″-OH),10.85(1H,s,7-OH),10.42(1H,s,4″′-OH),8.02(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,H-6′),8.00(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′′′,H-6′′′),7.12(1H,s,H-8″),7.04(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),6.97(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′′′,H-5′′′),6.94(1H,s,H-3),6.88(1H,br s,H-3″),6.50(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.20(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),3.90(3H,s,7″-OCH3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:164.3(C-2),103.8(C-3),181.8(C-4),161.5(C-5),98.8(C-6),164.2(C-7),94.0(C-8),157.2(C-9),103.8(C-10),124.2(C-1′),128.5(C-2′,C-6′),115.2(C-3′,C-5′),160.4(C-4′),163.2(C-2″),102.9(C-3″),182.2(C-4″),152.5(C-5″),124.8(C-6″),158.1(C-7″),92.0(C-8″),154.1(C-9″),104.0(C-10″),121.0(C-1″′),128.5(C-2″′,C-6″′),116.0(C-3″′,C-5″′),161.5(C-4″′),56.8(7″-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[28]報道基本一致,故鑒定化合物9為異柳杉雙黃酮。

化合物10土黃色粉末;HR-EI-MS:m/z539.098 4[M+H]+(calcd for C30H19O10,539.097 3);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.02(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,H-6′),7.97(2H,d,J=8.4 Hz,H-2?,H-6?),7.05(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),6.94(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),6.88(2H,s,H-3,H-3″),6.75(1H,s,H-8″),6.50(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.22(1H,d,J=2.0 Hz,H-6);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:164.3(C-2),103.9(C-3),181.7(C-4),160.5(C-5),99.0(C-6),163.0(C-7),94.6(C-8),157.0(C-9),104.0(C-10),124.2(C-1′),128.2(C-2′,C-6′),115.4(C-3′,C-5′),161.2(C-4′),164.2(C-2″),102.7(C-3″),182.0(C-4″),153.0(C-5″),124.8(C-6″),157.5(C-7″),94.0(C-8″),153.8(C-9″),104.3(C-10″),121.0(C-1′),128.5(C-2?,C-6?),116.0(C-3?,C-5?),161.4(C-4?)。以上數(shù)據(jù)與文獻[29]報道基本一致,故鑒定化合物10為扁柏雙黃酮。

化合物1～10的結構見圖3。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試結果

α-葡萄糖苷酶抑制活性測試結果表明,化合物8具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其IC50值為42.68±1.54 μmol/L,活性強度與陽性對照阿卡波糖(IC50=40.25±1.08 μmol/L)基本相當?；衔?、9和10表現(xiàn)出中等程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性,IC50值分別為72.14±2.67、61.26±4.32、55.43±2.17 μmol/L。其他化合物對α-葡萄糖苷酶均未表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

3 結論

本文利用多種現(xiàn)代色譜分離技術和波譜學方法,對地卷柏的化學成分以及生物活性進行研究,從地卷柏全草的95%乙醇提取物中分離鑒定了10個化合物,包括4個倍半萜、3個木脂素和3個雙黃酮。其中,化合物1為新的倍半萜類化合物,化合物2～10為首次從地卷柏中分離得到。采用PNPG法測試了所有化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性,結果顯示雙黃酮類化合物8～10具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,據(jù)此推測雙黃酮類化合物可能是地卷柏發(fā)揮降血糖活性的重要物質(zhì)基礎。本文首次揭示了地卷柏中抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分,研究結果豐富了地卷柏的化學成分,為該植物資源進一步的開發(fā)利用提供參考和科學依據(jù)。