基于數據挖掘、網絡藥理學及實驗驗證探討中藥治療變應性鼻炎的用藥規律及相關藥理分析

王笑雨,王 召,曹利華,賀紅娟,王真真,李秀敏,苗明三*

1河南中醫藥大學中醫藥科學院,鄭州 450046;2紐約醫學院 微生物和免疫學科,紐約 10595

變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又稱過敏性鼻炎,在特應性個體暴露于致敏原后,由免疫球蛋白E (immunoglobulin E,IgE)介導的以炎性因子(組胺、白三烯、前列腺素和血小板活化因子等)釋放、并由多種免疫活性細胞和免疫因子共同參與的鼻黏膜慢性非感染性炎癥[1]。炎性因子對鼻局部黏膜產生水腫滲出刺激鼻感覺神經,從而產生陣發性及反復性鼻癢、打噴嚏、清水樣涕等典型癥狀,也可伴有鼻塞、嗅覺減退、哮喘等癥狀[2]。AR除了過敏原以外,還與遺傳因素、地區氣候、空氣污染、神經和精神因素、社會經濟因素密切相關[3]。AR屬于中醫學“鼻鼽”的范疇,中醫認為此病為內外因共同作用的結果,內因多為臟腑虛損、正氣不足,外因多為風邪、寒邪或異氣侵襲,邪正相搏,肺氣不宣,發為鼻鼽[4]。臨床上主要采用抗組胺藥、鼻用糖皮質激素等治療AR,但是長期使用療效差,且易反復發作。中醫則通過口服、鼻腔沖洗中藥湯劑或穴位貼敷、中藥熏蒸、霧化等方法治療AR[5,6]。本文采用數據挖掘的方法分析中藥治療AR的用藥規律,并運用網絡藥理學及體內藥理學驗證的方法對高頻中藥藥對治療AR的潛在作用機制進行預測和驗證,為其臨床治療AR提供合理化參考和科學理論依據。

1 資料與方法

1.1 數據挖掘

1.1.1 數據來源

以中國知識資源總庫(CNKI)、萬方、維普三大數據庫為數據來源,以“中藥”、“變應性鼻炎”、“過敏性鼻炎”和“鼻鼽”為主題進行全文搜索,時間選取范圍是2000年1月至2023年2月,共檢索到9 442篇期刊文獻。

1.1.2 納入與排除標準

剔除實驗研究、綜述、聯合用藥、使用重復方劑、無具體藥物組成等文獻,排除加減方、序貫治療方,舍去單味藥機制研究的文獻,僅選擇中藥復方治療AR的臨床研究文獻共252篇。

1.1.3 數據處理

按照納入與排除標準,最終篩選出符合標準的252首中藥方劑,并錄入Excel 2016處理,以此建立中藥復方治療AR的數據庫。根據《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020版[7]和人衛版“十三五”規劃教材《中藥學》[8]上述中藥名稱、分類、性味歸經及功效進行統一,如“川弓”“川穹”統一為“川芎”,“北芪”統一為“黃芪”,“白芥子”統一為“芥子”,“元胡”統一為“延胡索”,“辛夷花”“辛荑”統一為“辛夷”,“制附子”統一為“附子”,“蒼耳”統一為“蒼耳子”等。

1.1.4 統計分析

采用Excel 2016軟件252首復方所含單味中藥的藥物類型、四氣五味歸經進行用藥頻次統計分析;采用IBM SPSS Modeler 18.0 軟件對高頻中藥進行關聯規則分析,挖掘單味中藥間的潛在關聯;利用GraphPad Prism 8.0軟件對高頻中藥的用藥劑量進行統計分析。使用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對高頻中藥進行系統聚類分析。

1.2 網絡藥理學

1.2.1 活性成分篩選及靶點預測

根據數據挖掘結果分析,將最高頻藥對組合作為研究對象,進行網絡藥理學分析。使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP數據庫,http://tcmspw.com/tcmsp.php)及文獻補充獲取藥對組合的化學成分,利用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和OpenBabel.2.4.1軟件獲取成分SMILES號,再通過TCMSP數據庫、SwissTargetPrediction數據庫(swisstargetprediction.ch/)、SEA數據庫(sea.bkslab.org/)、PubChem數據庫(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和DrugBank數據庫(https://www.drugbank.com/)獲取成分的靶點信息。

1.2.2 獲取疾病靶點并構建“成分-靶點-疾病網絡”

以“allergic rhinitis”作為關鍵詞,從TTD數據庫(db.idrblab.net/ttd/)、DisGeNet數據庫(disgenet.org/)、GAD數據庫(geneticassociationdb.nih.gov/)及DrugBank數據庫中檢索與AR相關發病機制靶點,合并、去重后與成分靶點取交集即得該藥對組合治療AR的潛在疾病靶點。利用Uniprot數據庫對上述獲取的成分靶點及疾病靶點進行基因名稱標準化處理,利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“成分-靶點-疾病”可視化網絡。

1.2.3 富集分析

利用Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對潛在疾病靶點進行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的富集分析,并通過微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn)進行可視化展示。

1.2.4 構建“成分-靶點-通路-疾病”網絡

通過KEGG富集分析結果,分析關鍵通路、核心靶點蛋白及核心成分之間的關系,利用Cytoscape 3.7.2軟件,構建“成分-靶點-通路-疾病”可視化網絡。

1.2.5 分子對接

首先,通過“成分-靶點-通路-疾病”網絡分析,選取度值 ≥ 5的靶點作為受體,通過PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載其分子結構,利用Pymol軟件去水去殘基,再使用Autodock軟件加氫處理后另存為pdbqt文件。其次,從PubChem數據庫下載核心成分的分子結構,通過Chem3D軟件轉換為mol2文件,再利用Autodock軟件處理后另存為pdbqt文件。最后,使用Autodock Vina軟件對蛋白受體與核心成分小分子配體進行分子對接結合能分析。根據分析結果,選擇結合能最低的靶點蛋白-小分子配體復合物作為最優選擇,進行分子對接可視化展示。

1.3 體內驗證實驗

1.3.1 實驗動物

4～6周雌性Balb/c小鼠(合格證號:20230512Zbzz0619000975),體重16～18 g,共45只,采購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號SCXK(浙)2019-0001),環境溫度(21±2) ℃,環境相對濕度30%～70%,正式實驗前適應性飼養7 d,給予自由飲食和交替12 h光照。小鼠適應良好,毛色健康,四肢及大小便正常,體重穩定增長。河南中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會已對本課題所涉及的動物實驗予以批準(批準編號:DWLLGZR202303189)。

1.3.2 試劑及藥品

豚草花粉(ragweed,RW)(批號:366782,美國Stallergenes Greer公司);免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-10(interleukin 10,IL-10)ELISA試劑盒(批號:3815-1H-6、3511-1A-20、3361-1A-6、3432-1A-6,瑞典Mabtech公司);組胺ELISA試劑盒(批號:MM-0548M1,江蘇酶免實業有限公司);PAGE凝膠快速制備試劑盒(批號:03655300,上海雅酶生物醫藥科技有限公司);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度試劑盒(批號:PC0020,北京索萊寶科技有限公司);小鼠GAPDH抗體(批號:AB0037,上海泊灣生物科技有限公司);前列腺素-內過氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、熱休克蛋白(heat shock protein 90,HSP90)、誘導型一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase 2,NOS2)抗體(批號:bs-10411R、bsm-61215M、bs-20601R,北京博奧森生物科技有限公司);氯雷他定片(loratadine,LT,批號:2106027,揚子江藥業集團上海海尼藥業有限公司)。

中藥黃芪(批號:230603)和辛夷(批號:230601-2)購買于河南張仲景大藥房股份有限公司。參考《中國藥典》2020版[7],黃芪:辛夷(3∶1)浸泡過夜后用75%乙醇加熱回流三次,收集濾液用旋轉蒸發儀減壓濃縮,置于-20 ℃冷預凍過夜,隨后在冷凍干燥機中進行冷凍干燥至恒質量,即得黃芪-辛夷醇提物,得率為30.44%。

1.3.3 造模及分組

將小鼠隨機分為5組,每組9只:正常對照組(C)、模型組(M)、氯雷他定陽性對照組(1.7 mg/kg,LT),黃芪-辛夷醇提物高劑量組(3.04 g/kg,HQ-XYG),黃芪-辛夷醇提低劑量組(1.52 g/kg,HQ-XYD)。除C組外,其余各組小鼠在第1、8 d腹腔注射(i.p.)豚草花粉溶液Ⅱ(500 μL含200 μg RW和2.5 mg Alum的PBS溶液)各一次;第15、22、29～33 d,C組小鼠給予鼻腔滴注(i.n.)PBS 10 μL各一次,其余組小鼠給予鼻腔滴注(i.n.)豚草花粉溶液Ⅱ(10 μL含500 μg RW的PBS溶液)各一次;第15 d開始,各給藥組灌胃給予相應劑量的相應藥物,C組和M組以相同給藥方式給予0.9%生理鹽水,共給藥18 d。

1.3.4 指標檢測

1.3.4.1 小鼠行為學觀察

從造模開始的第29～33 d,每次豚草花粉鼻腔激發及給藥后,立刻觀察并記錄各組小鼠15 min內小鼠撓鼻次數和打噴嚏次數。

1.3.4.2 ELISA法檢測小鼠血漿中組胺的水平

小鼠末次激發后眼球取血1～2滴置于EDTA抗凝離心管中,將全血與抗凝劑充分混合,4 ℃、10 800 r/min離心20 min,取上清液即為血漿,利用ELISA法檢測血漿中組胺含量,詳細操作步驟參照試劑盒說明。

1.3.4.3 ELISA法檢測小鼠血清中總IgE、RW特異性IgE、TNF-α和IL-10水平

小鼠末次激發后眼球取血,室溫下靜置2 h,4 ℃、10 800 r/min離心20 min,取上清液即為血清,利用ELISA法檢測血清中總IgE、RW特異性IgE、TNF-α和IL-10水平,詳細操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.4.4 ELISA法檢測小鼠肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10水平

小鼠末次激發處死后,解剖暴露氣管,分別用1 mL無菌生理鹽水分三次灌洗肺部和沖洗小鼠前鼻腔,分別得肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液,并于4 ℃ 3 000 r/min離心5 min,取上清于-20 ℃凍存。利用ELISA法檢測肺小鼠泡灌洗液和鼻腔灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10水平,詳細操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.4.5 免疫印跡法檢測肺組織中PTGS2、HSP90和NOS2蛋白表達

每組隨機取3只小鼠肺組織,按照15 mg/μL加入組織裂解液進行總蛋白的提取,使用BCA試劑盒檢測總蛋白含量。通過上樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳、PVDF轉膜、脫脂奶粉封閉后,加入按比例稀釋后的一抗PTGS2、HSP90、NOS2和GAPDH抗體,4 ℃下孵育過夜;TBST溶液清洗3次后,加入稀釋后的HRP標記的羊抗兔二抗搖床孵育1 h,洗膜3次后使用超靈敏發光檢測試劑盒顯色后顯影,利用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3.4.6 統計學分析

2 結果

2.1 數據挖掘

2.1.1 單味藥用藥頻次分析

將錄入的252首中藥方劑中的全部中藥進行排序,統計得出共有223味中藥,累計頻率2 473次,其中用藥頻次 ≥ 30的高頻中藥共21種,累計出現1 598次,占比64.62%,其中以辛夷、黃芪、防風、甘草、蒼耳子等的使用頻次相對較高(見表1)。

表1 頻次 ≥ 30的單味中藥

2.1.2 高頻中藥性味分析

依據《中國藥典》2020年版和《中藥學》分類標準,對納入標準的高頻中藥(用藥頻次 ≥ 30)進行性味的統計分析。將同一味中藥的不同性味分別統計入內。統計結果表明,藥味涉及辛(868次,38.70%),甘(767次,34.20%),苦(309次,13.78%),酸(129次,5.75%),微苦(49次,2.18%),澀(48次,2.14%),淡(40次,1.78%)和咸(33次,1.47%),見圖1A;藥性涉及溫(852次,53.32%),微溫(292次,18.27%),平(254次,15.89%)寒(126次,7.88%),涼(44次,2.75%)和微寒(30次,1.88%),結果見圖1B。

圖1 中藥治療AR單味藥藥味(A)及藥性(B)分析

2.1.3 高頻中藥歸經分析

依據《中國藥典》2020年版和《中藥學》分類標準,對納入標準的高頻中藥(用藥頻次 ≥ 30)進行歸經的統計分析。將同一味中藥的不同歸經分別統計入內。統計結果顯示,高頻中藥歸經涉及肺(1 242次,29.86%)、脾(771次,18.53%)、胃(522次,12.55%)、心(390次,9.38%)、肝(379次,9.11%)、膀胱(277次,6.66%)、腎(204次,4.90%)、大腸(201次,4.83%)、膽(87次,2.09%)、小腸(47次,1.13%)和心包(40次,0.96%)(見表2)。

表2 中藥治療AR單味藥歸經分析

2.1.4 高頻中藥功效分析

將21味高頻中藥(用藥頻次 ≥ 30)參考《中藥學》進行功效分類規范,共涵蓋了9種功效分類,涉及解表藥(725次,45.37%)、補虛藥(465,29.10%)、祛風濕藥(117次,7.32%)、收澀藥(99次,6.20%)、清熱藥(47次,2.94%)、活血化瘀藥(40次,2.5%)、利水滲濕藥(40次,2.5%)、平肝熄風藥(33次,2.07%)和化痰止咳平喘藥(32次,2%)(見圖2)。

圖2 中藥治療AR功效分析

2.1.5 高頻中藥關聯規則分析

使用IBM SPSS Modeler 18.0軟件對高頻中藥(用藥頻次 ≥ 30)進行關聯規則分析,建立“數據→類型→網絡”的關聯規則數據流,設置“弱鏈接上限”為15,“強鏈接下限”為45,得到頻數 ≥ 60的藥物組合21種(見表3),并將高頻中藥間的關聯網絡圖進行可視化展示(見圖3)。設置支持度為12%,置信度為95%,提升度 ≥ 1,最大前項數為5,利用Apriori建模進一步挖掘個高頻中藥之間的配伍關系,結果得到11對核心藥物組合(見表4)。

表3 中藥方劑中頻次 ≥ 60的藥物組合

表4 高頻中藥治療AR關聯規則分析

2.1.6 高頻中藥劑量分析

利用Graphpad Prism 8.0軟件對21味高頻中藥(用藥頻次 ≥ 30)進行劑量統計分析。結果顯示在高頻藥物劑量使用中,常用劑量除五味子、蟬蛻和薄荷超出外,其余高頻藥物均在《中國藥典》規定用量范圍之內,詳見圖4。圖中以藥物中文名稱首字母縮寫代表相應中藥。

2.1.7 高頻中藥治療AR聚類分析

利用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對21味高頻中藥(用藥頻次 ≥ 30)進行“瓦爾德”聚類分析。取類間距離18,將藥物分為四類,聚一類:1組(黃芪、白術、防風、甘草、茯苓、黨參),2組(烏梅、蟬蛻、地龍),3組(桂枝、白芍、五味子);聚二類:辛夷、蒼耳子、白芷、薄荷、黃芩、川芎;聚三類:細辛、芥子;聚四類:麻黃,詳見圖5。

圖5 中藥治療AR聚類分析

2.2 網絡藥理分析

根據數據挖掘結果顯示,黃芪-辛夷(HQ-XY)藥對是中藥臨床治療AR使用頻率最高的藥物組合,出現頻次為121次,為進一步探討黃芪-辛夷藥對治療AR的分子作用機制,現運用網絡藥理學、分子對接等手段進行深層次分析。

2.2.1 黃芪-辛夷藥對活性成分篩選及靶點預測

使用TCMSP數據庫獲取黃芪和辛夷的活性成分,并按照藥動學參數(ADME)進行篩選,設置篩選標準為:口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥ 30%,類藥性(drug-likeness,DL)≥ 0.18,并進一步通過文獻補充未納入的主要成分,共得到黃芪活性成分24個,辛夷活性成分24個,合并后共得到48個活性成分,相關信息詳見表5。其中,黃芪異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素等是中藥黃芪代表性成分,木脂素、玉蘭花堿、辛夷脂素等為中藥辛夷代表性成分。通過TCMSP、SwissTargetPrediction、SEA、PubChem和DrugBank數據庫獲取上述活性成分的靶點信息,合并、去重后共得到306個可能的活性靶點。

表5 黃芪-辛夷藥對的活性成分

2.2.2 獲取AR疾病靶點并“成分-靶點-疾病”網絡的構建

從TTD、DisGeNet、GAD及DrugBank數據庫中檢索與AR相關發病機制靶點,合并、去重后得到AR疾病靶點321個。將306個黃芪-辛夷成分靶點和321個疾病靶點取交集得到63個黃芪-辛夷藥對治療AR的潛在疾病靶點。利用Uniprot數據庫對上述獲取的成分靶點及疾病靶點進行基因名稱標準化處理,利用Cytoscape 3.7.2,軟件構建“成分-靶點-疾病”可視化網絡,詳見圖6。該網絡包含35個活性成分節點,63個靶點蛋白節點和347條邊(注:有13個活性成分未找到對應靶點,故網絡中只顯示35個有效成分節點)。

圖6 黃芪-辛夷藥對治療AR的“成分-靶點-疾病”網絡

2.2.3 GO基因功能富集分析和KEGG通路富集分析

將63個潛在作用靶點在線導入Metascape網站,限定物種為人,設定閾值為P<0.05,進行GO和KEGG富集分析。

在GO分析富集中,共得到生物過程(biological progress,BP)條目共656個,細胞組分(cellular components,CC)條目36個,分子功能(molecular functions,MF)條目共122個。GO分析結果表明,相關靶點主要涉及對外源性刺激的反應(response to xenobiotic stimulus)、血液循環調節(regulation of blood circulation)、血管直徑維持(blood vessel diameter maintenance)以及管徑調節功能(regulation of tube diameter)等生物過程,參與G蛋白偶聯胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、腎上腺素受體活性(adrenergic receptor activity)和血紅素結合(heme binding)等分子功能,與膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、突觸膜(synaptic membrane)、頂端質膜外側(external side of apical plasma membrane)及等離子體膜筏(plasma membrane raft)等細胞組分密切相關。篩選BP、CC、MF的前10位做成柱狀圖(見圖7A)進行展示。

圖7 黃芪-辛夷藥對治療AR核心靶點的GO基因功能富集分析(A)和KEGG通路富集分析(B)

KEGG富集分析P<0.05的目錄有92個,將顯著性最高的前20個通路做成氣泡圖(見圖7B)進行展示。結果表明,辛夷-黃芪藥對治療AR的主要靶點重點涉及神經活性配體-受體相互作用通路(neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣離子信號通道(calcium signaling pathway)、類固醇激素生物合成通路(steroid hormone biosynthesis)、癌癥通路(pathways in cancer)、脂質與生物合成通路(lipid and atherosclerosis)、化學致癌-受體活化通路(chemical carcinogenesis-receptor activation)和cAMP信號通路等信號通路(cAMP signaling pathway)等。

2.2.4 構建“成分-靶點-通路-疾病”網絡

通過KEGG富集分析發現,有四個關鍵通路的潛在靶點蛋白個數超過10個,分別是神經活性配體-受體相互作用通路(P1,19個)、鈣離子信號通道(P2,14個)、類固醇激素生物合成通路(P3,11個)和癌癥通路(P4,11個);四條關鍵通路共涉及39個關鍵靶點蛋白和34個活性成分,利用Cytoscape 3.7.2軟件,構建“成分-靶點-通路-疾病”可視化網絡(見圖8),圖中節點大小和顏色深淺與網絡中的靶點度值呈正相關。結果顯示,黃芪-辛夷藥對活性成分主要通過作用于PTGS2、HSP90AA1、CALM1、NOS2、ADRA1B、CHRM1、ADRB2、CHRM3、CYP1B1等靶點調控上述四條通路實現對AR的治療作用。

圖8 黃芪-辛夷藥對“成分-靶點-通路-疾病”網絡

2.2.5 分子對接驗證

分析四條關鍵通路、39個潛在靶點蛋白(度值 ≥ 8)及34個對應化合物的相互關系(見表6),選擇度值較高的PTGS2(P4)、CHRM1(P1,2)、CYP1B1(P3)代表四條關鍵通路,與相應化合物進行分子對接結合能分析,結果見圖9。根據結合能越低活性分子與靶點蛋白結合穩定性越高、結合能力越強的原則,因此選擇結合能最小的PTGS2-X2(-10.2 kcal/mol)、PTGS2-H18(-9.5 kcal/mol)、CHRM1-H7(-9.2 kcal/mol)、CYP1B1-H8(-10.5 kcal/mol)和CYP1B1-H7(-9.9 kcal/mol)進行分子對接可視化展示,如圖10結果顯示黃芪-辛夷藥對中的活性成分山柰酚、槲皮素、芒柄花黃素和細辛素在治療AR中發揮重要作用。

圖9 核心靶點和相應化合物的最低結合能

圖10 分子對接模式

表6 關鍵通路、潛在靶點蛋白及有效化合物的關系表格

2.3 體內實驗驗證

2.3.1 各組小鼠AR癥狀觀察及比較

觀察連續鼻腔激發5 d的小鼠行為學變化:與C組相比,M組小鼠的撓鼻和噴嚏次數呈現顯著增加趨勢、并在末次激發后達到最高峰(平均撓鼻64.2次、噴嚏16次);LT組小鼠撓鼻和噴嚏次數在連續激發的第2～3 d有所增加、但第4～5 d呈現明顯下降趨勢并在第5 d達到與對照組相當的水平(平均撓鼻21.8次、噴嚏0.8次);HQ-XYG組小鼠的噴嚏和撓鼻次數一直穩定保持在與對照組相當的水平(平均撓鼻15.6次、1.8次);HQ-XYD組小鼠的撓鼻和噴嚏次數分別在第2 d和第3 d呈現一個小高峰,但整體水平相比模型組呈現被抑制狀態,最后一天的撓鼻和噴嚏次數呈現較低水平(平均撓鼻26.4次、噴嚏6.4次),詳見圖11。

圖11 連續5 d每次激發后15 min內各組小鼠行為學觀察

2.3.2 各組小鼠血漿中組胺水平比較

與C組小鼠比較,M組小鼠血漿中組胺水平顯著上升(P<0.001)。與M組比較,LT組、HQ-XYG組和HQ-XYD組小鼠血漿中組胺水平顯著下降(P<0.001,P<0.01),詳見圖12。

圖12 各組小鼠血漿中組胺水平比較

2.3.3 各組小鼠血清中IgE、RW特異性IgE、TNF-α、IL-6和IL-10水平比較

與C組小鼠比較,M組小鼠血清中總IgE、RW特異性IgE、TNF-α水平顯著上升(P<0.001),IL-10水平顯著下降(P<0.001)。與M組相比,LT組、HQ-XYG組和HQ-XYD組小鼠血清中總IgE、RW特異性IgE、TNF-α水平顯著下降(P<0.001),IL-10 水平顯著上升(P<0.01,P<0.001)(見圖13)。

圖13 各組小鼠血清中總IgE、RW特異性IgE、TNF-α、IL-6和IL-10水平比較。

2.3.4 各組小鼠肺泡灌洗液及鼻腔灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10水平

與C組小鼠比較,M組小鼠肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液中TNF-α和IL-6水平顯著上升(P<0.001),IL-10水平顯著下降(P<0.05,P<0.01)。與M組小鼠比較,LT組、HQ-XYG組和HQ-XYD組小鼠肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液中TNF-α和IL-6水平顯著下降(P<0.01,P<0.001),LT組和HQ-XYG組小鼠肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液中IL-10水平顯著上升(P<0.05,P<0.01,P<0.001),HQ-XYD組小鼠肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液中IL-10水平差異無統計學意義,詳見圖14和圖15。

圖14 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10水平比較。

圖15 各組小鼠鼻腔灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10水平比較。

2.3.5 各組小鼠肺組織中PTGS2、HSP90和NOS2蛋白表達比較

與C組小鼠比較,M組小鼠肺組織中PTGS2、HSP90和NOS2的蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。與M組小鼠比較,LT組和HQ-XYG組小鼠肺組織中PTGS2、HSP90和NOS2蛋白表達水平顯著下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001),HQ-XYD組小鼠肺組織中NOS2蛋白表達水平顯著降低(P<0.001),HQ-XYD組小鼠肺組織中PTGS2和HSP90蛋白表達水平差異無統計學意義。詳見圖16和圖17。

圖16 各組小鼠肺組織中PTGS2、HSP90和NOS2蛋白表達水平比較。

圖17 各組小鼠肺組織中PTGS2、HSP90和NOS2蛋白表達水平比較

3 討論與結論

治療AR的中藥用藥頻次分析中,使用頻次最高的前五位中藥為辛夷、黃芪、防風、甘草、蒼耳子。辛夷作為用藥頻次最高的單味中藥,性溫,能散風寒、通鼻竅,主要成分為揮發油類、木脂素類及生物堿類化合物,具有保護黏膜、改善局部血液循環、抗炎、抗菌、抗過敏、抗氧化以及舒張平滑肌等廣泛的藥理作用[18]。辛夷常作為君藥用于治療各種鼻炎及鼻部疾病的藥劑中,如辛夷鼻炎丸、鼻炎康片、鼻淵丸、通竅鼻炎顆粒、辛芳鼻炎膠囊、辛夷散、辛夷丸、辛夷膏、鼻竇灌注液等。李時珍在《本草綱目》[19]中也記載:“辛夷能溫中,治頭面目鼻九竅之病”。

經研究發現,在252首中藥方劑中,藥物分類主要以解表藥(辛夷、防風、細辛、白芷、桂枝等)和補虛藥(黃芪、甘草、白術、等)為主,藥性大多集中于溫,藥味以辛、甘為主。溫藥具有溫中祛寒、補火助陽的作用,辛味藥能散風寒、行氣血,甘味藥有調和藥性、補益和中的作用,藥物歸經多涉及肺經、脾經和肝經。綜合分析,治療AR的單味中藥多為辛溫解表藥(辛夷、防風、蒼耳子、細辛、白芷、桂枝等),主要用于惡寒發熱、頭痛、無汗、肢體酸痛、清涕、鼻塞、苔薄白、喉癢咳嗽、脈浮的風寒表現。

在關聯規則分析中,支持度較高的核心藥物組合為黃芪-白術-防風-辛夷、黃芪-蒼耳子-白術-防風、黃芪-白芷-白術-辛夷、黃芪-蒼耳子-白術-防風-辛夷、黃芪-白芷-白術-防風、黃芪-白芷-白術-防風-辛夷,由此可見,中藥治療AR多選用解表藥、補虛藥、祛風解濕藥,符合中醫對AR發病機制(肺氣虛寒、脾氣虛弱、腎陽虧虛以及風寒襲表)的理解。除五味子、蟬蛻和薄荷外,其余高頻藥物常用劑量均在《中國藥典》規定用量范圍內。

在聚類分析中,聚一類中藥以補虛藥和解表藥為主,其中一組黃芪的主要活性成分黃芪多糖可以緩解AR噴嚏、撓鼻和流涕等癥狀,能夠通過上調AR大鼠鼻黏膜組織中T-bet和IFN-γmRNA表達、下調GATA-3和IL-4 mRNA表達減輕AR大鼠鼻黏膜組織炎癥情況[20],并能夠降低血清IL-4、IL-6、IL-1β、IgE、TNF-α等炎性因子的水平促進AR的痊愈[21]。防風具有祛風解表、勝濕止癢的功效,防風多糖經體外實驗證明有良好的抗過敏功效,防風醇提物能夠通過降低體外細胞的PAR-2的表達發揮抗過敏作用[22]。桂枝具有發汗解肌,溫通經脈,助陽化氣,散外感風邪的功效。聚二類蒼耳子有散風寒、通鼻竅、祛風濕之功效,用于風寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、風濕瘙癢、濕痹拘攣;蒼耳子正丁醇萃取部位能夠緩解AR豚鼠的鼻黏膜炎癥反應,降低白細胞數、嗜酸粒細胞百分比、血清SIgE水平[23];蒼耳子水提物能夠減輕AR豚鼠鼻黏膜脫落、組織水腫及炎癥細胞浸潤等癥狀,降低血清中炎性細胞因子IgE、IL-4和IFN-γ的表達水平[24]。

本文通過TCMSP數據庫搜索及文獻補充,共得到黃芪-辛夷藥對中的有效成分共有48個,對應作用靶點306個,每個成分都多用于多個靶點,為進一步說明作用靶點與成分之間的關系,將成分靶點與疾病靶點取交集后構建“成分-靶點-疾病”網絡,顯示主要成分山柰酚、槲皮素與靶點關聯度最高,可能是黃芪-辛夷治療AR的關鍵成分,發揮重要的藥理作用。有研究表明山柰酚能夠通過改善腸道屏障的完整性降低腸道炎癥的發生,且具有顯著的抗高血糖、抗氧化作用[25];槲皮素能夠通過抑制galectin-3和NLRP3的結合顯著降低動脈粥樣硬化性炎癥[26]。進一步通過KEGG通路分析,發現神經活性配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通道、類固醇激素生物合成通路和癌癥通路是黃芪-辛夷抗AR的主要作用通路,涉及34個活性成分和39個核心靶點,通過分析“成分-靶點-通路-疾病”關系,我們發現PTGS2、HSP90、NOS2、CALM1、CHRM1、CYP1B1等是通路中起主要作用的靶點蛋白。PTGS2參與炎癥或腫瘤等病理反應,是非甾體類抗炎藥物的作用靶點,能夠被促炎細胞因子和生長因子等高度誘惑分泌炎癥因子,引發炎癥反應[27]。HSP90是一種ATP依賴性分子伴侶,能夠協助客戶蛋白完成正確的空間折疊并參與細胞周期調節,有研究表明在機體生理應激狀態下HSP90能夠調控淋巴細胞的活化、促進淋巴細胞遷移至感染部位、促進局部炎性反應的發生[28]。NOS2是一種機體損傷后誘導表達的誘導型一氧化氮合成酶,能夠利用一氧化氮的氧化應激作用參與機體的免疫調控和炎性反應。CALM1是一種鈣調蛋白,CALM1過表達能異常激活細胞鈣離子信號通道,最終引發機體炎癥反應和一定程度的肝臟損傷。CHRM1是一種副交感神經受體,有研究表明CHRM1激動劑能夠通過增強細胞鈣離子活性調控神經元分化[29],在分子對接驗證中與山柰酚結合能低、可通過調控激活鈣離子通道引發細胞炎癥因子的釋放。CYP1B1是類固醇激素合成通路的主要參與蛋白,類固醇激素具有顯著的抗炎抗過敏等免疫調控作用,在分子對接驗證中與槲皮素和山柰酚有良好穩定的結合能力。通過上述分析可以看出,黃芪-辛夷中主要成分可能通過PTGS2、HSP90、NOS2、CALM1、CHRM1、CYP1B1等靶點作用于神經活性配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通道、類固醇激素生物合成通路和癌癥通路發揮治療AR的作用。本研究為進一步驗證上述預測結果的可靠性,構建豚草花粉誘導的AR小鼠模型展開體內實驗驗證,研究結果表明:黃芪-辛夷藥對能夠降低AR小鼠體內PTGS2、HSP90、NOS2的蛋白表達,抑制AR小鼠血清、鼻腔灌洗液和肺泡灌洗液中炎性因子組胺、IgE、TNF-α和IL-6的表達水平,升高抗炎因子IL-10的表達,顯著緩解AR小鼠撓鼻和打噴嚏癥狀,揭示了黃芪-辛夷藥對可能通過抑制HSP90/PTGS2/NOS2通路,進而抑制炎性反應的發生發展,達到干預AR的效果。

綜上所述,通過數據挖掘統計分析和網絡藥理學技術對臨床治療AR的用藥規律進行總結,并深入研究高頻藥物組合黃芪-辛夷治療AR的分子作用機制,分子對接模擬驗證了黃芪-辛夷多成分、多靶點、多通路的作用特點,并通過體內實驗驗證了黃芪-辛夷藥對可能是通過抑制HSP90/PTGS2/NOS2通路進而抑制炎性反應的發生、緩解小鼠AR癥狀、最終達到治療AR的作用。本研究結果能夠為辛夷-黃芪藥對在臨床上的合理用藥提供科學的理論依據,進一步推動中藥治在療變應性鼻炎中的應用。