基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)的江西特產(chǎn)中藥茶芎化學(xué)成分研究

鄭 鵬,黃 敏,張金蓮*,鄭郁清,商 杰,郭靜英,劉明貴,徐蔥蘢

1江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南昌 330004;2江西景德中藥股份有限公司,景德鎮(zhèn) 333302

茶芎來源于傘形科藁本屬植物茶芎(LigusticumsinenseOliv.cv.Chaxiong Mss.)的干燥根莖,其性溫,味辛,歸肝、心經(jīng),具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)茶芎還具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓形成、促進(jìn)血管擴(kuò)張等作用[2],在放射性口腔炎[3]、腦卒中[4]、血栓性疾病[5]、新型冠狀病毒肺炎[6]等方面有一定的治療效果。茶芎是江西省特產(chǎn)中藥材之一,主要產(chǎn)于九江地區(qū)的武寧、瑞昌、德安等縣市,是當(dāng)?shù)刂匾闹兴庂Y源和經(jīng)濟(jì)作物。茶芎藥用歷史悠久,古代稱為“撫芎”,與川芎等合稱為“芎穹”,最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品[7]。宋代以后,“撫芎”名稱出現(xiàn)分化[8],清代《本草綱目拾遺》[9]、《本經(jīng)逢原》[10]和《得配本草》[11]等著作均有記載,現(xiàn)收載于2014年版《江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》。

目前關(guān)于茶芎化學(xué)成分的研究報(bào)道較少,現(xiàn)有的文獻(xiàn)主要涉及苯酞類、有機(jī)酚酸類、生物堿類和多糖等化學(xué)成分的分離鑒定,但這些研究周期長(zhǎng)、效率低,且多數(shù)文獻(xiàn)年代較早,缺乏全面性和創(chuàng)新性。為了提高茶芎化學(xué)成分的分離效率和純度,Gong等[12]采用高效液相色譜(HPLC)法建立了茶芎的指紋圖譜,并指認(rèn)和測(cè)定了其主要成分如綠原酸和阿魏酸等。然而,相關(guān)藥理研究多以粗提物為對(duì)象,對(duì)于茶芎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制還不夠深入探討,導(dǎo)致茶芎的臨床應(yīng)用受到限制。因此,明確茶芎的物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)于開展相關(guān)的藥效學(xué)研究、進(jìn)一步應(yīng)用和開發(fā)茶芎有著重要意義。

超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)分析技術(shù)具有快速、高效、靈敏度高等特點(diǎn),能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)化合物的快速分離和精確鑒定,在中藥研究方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[13]。前人研究發(fā)現(xiàn),在正離子模式下苯酞類成分、氨基酸類成分和生物堿類成分響應(yīng)較強(qiáng)[14],而在負(fù)離子模式下有機(jī)酚酸類成分響應(yīng)程度更好[15]。因此,本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),同時(shí)采用正離子和負(fù)離子兩種離子化模式檢測(cè),對(duì)茶芎化學(xué)成分進(jìn)行快速分析,進(jìn)一步明確了茶芎中苯酞類、有機(jī)酚酸類、生物堿類等多種化學(xué)成分的構(gòu)成,為茶芎的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

茶芎采收于江西省武寧縣,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)張壽文教授鑒定為傘形科植物茶芎(LigusticumsinenseOliv.cv.Chaxiong Mss.)的干燥根莖;色譜級(jí)甲酸(批號(hào):73C1812PR),色譜級(jí)乙腈(批號(hào):302Y1906HB),均購(gòu)于美國(guó)ACS公司;屈臣氏飲用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司);其余試劑為分析純。

1.2 儀器

Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀,配備ESI離子源及Anaiyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件;Peak View數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)AB SCIEX公司)。

1.3 供試品溶液制備

取茶芎粉末(過四號(hào)篩)約0.8 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入80%甲醇10 mL,密塞,稱定重量,超聲25 min,放冷,稱定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,13 000 r/min離心10 min,取上清液,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

1.4 色譜條件

采用Titank C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱,以乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0～10 min,5%→50% A;10～18 min,50%→55% A;18～30 min,55%→65% A;30～40 min,65%→95% A;40～42 min,95% A;42～42.1 min,95%→5% A;42.1～45 min,5% A),柱溫40 ℃,流速0.25 mL/min,進(jìn)樣量3 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI),正、負(fù)離子檢測(cè)模式。掃描方式為全掃描,質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000;噴霧電壓(ISVF)5 500 kV;離子源溫度(TEM)500 ℃;去簇電壓(DP)100 V;碰撞能量(CE)35 eV,碰撞能量疊加(CES)35±15 eV;氣簾氣壓力(CUR)40 kPa;霧化器GS1和輔助氣GS2壓力為50 kPa;數(shù)據(jù)采集時(shí)間46 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集軟件:Analyst 1.6;數(shù)據(jù)分析軟件:Peakview 1.2。通過CNKI、SciFinder、Geenmedical、TCMSP、PubMed等平臺(tái)及數(shù)據(jù)庫(kù),查閱相關(guān)文獻(xiàn),收集茶芎以及藁本屬植物報(bào)道的化合物信息,匯總后刪除重復(fù)的成分,建立成分的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),其中包含化合物名稱、分子式、分子量等基本信息。將液質(zhì)聯(lián)用儀采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Peakview 1.2軟件中,利用XIC Manager插件進(jìn)行無目標(biāo)篩查,對(duì)篩查出的化合物進(jìn)行碎片離子比對(duì),結(jié)合色譜保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、特征碎片離子、MS/MS裂解規(guī)律和文獻(xiàn)報(bào)道等指征茶芎的化學(xué)成分。

2 結(jié)果

通過UPLC-Q-TOF-MS對(duì)茶芎的化學(xué)成分進(jìn)行分析,得到正離子和負(fù)離子模式的質(zhì)譜總離子流圖見圖1。根據(jù)“1.6”項(xiàng)下數(shù)據(jù)分析方法,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,從茶芎中共鑒定出72個(gè)化合物,其中苯酞類化合物33個(gè),有機(jī)酸類成分32個(gè),生物堿類成分5個(gè),其他類成分2個(gè),結(jié)果見表1。

表1 茶芎化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

圖1 茶芎正離子(A)和負(fù)離子(B)模式總離子流圖

2.1 苯酞類

苯酞類成分是從茶芎中鑒定得到數(shù)量最多的成分,也是最主要的藥效成分。其主要包括簡(jiǎn)單苯酞類和苯酞二聚體類兩種類型。

2.1.1 簡(jiǎn)單苯酞類

簡(jiǎn)單苯酞類化合物裂解方式主要有2種,一種是苯酞類化合物側(cè)鏈斷裂脫烯(CnH2n)產(chǎn)生[M-CnH2n+H]+碎片,另一種是苯酞內(nèi)酯環(huán)開環(huán)脫水再脫羰基,產(chǎn)生[M+H-H2O]+、[M+H-H2O-CO]+碎片。本研究從茶芎中鑒別出的簡(jiǎn)單苯酞類成分21個(gè),包括化合物30～33、37～40、44～47、49、50～54、56、58、59。以化合物50為例進(jìn)行解析,化合物50的準(zhǔn)分子離子峰為m/z193.123 2[M+H]+,根據(jù)元素組成分析,判斷該化合物的分子式為C12H16O2,其裂解方式主要有2種。其一,苯酞類化合物側(cè)鏈斷裂失去一分子C4H8得到碎片離子m/z137.059 8[M+H-C4H8]-;其二,苯酞內(nèi)酯環(huán)開環(huán)脫去一分子H2O得到碎片離子m/z175.112 3[M+H-H2O]-,繼續(xù)脫去一分子CO得到碎片離子m/z147.116 7[M+H-H2O-CO]-,繼而脫去一分子C3H6得到碎片離子m/z105.069 1[M+H-H2O-CO-C3H6]-(見圖2),與文獻(xiàn)[13,14]報(bào)道的裂解方式基本一致,故推測(cè)化合物50為洋川芎內(nèi)酯A。

圖2 洋川芎內(nèi)酯A可能的質(zhì)譜裂解途徑

2.1.2 苯酞二聚體類

苯酞二聚體類化合物是一類由2個(gè)苯酞單體聚合物形成的化合物,在高能量撞擊下易開環(huán),形成苯酞單體碎片離子,在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生與上述單體相同的特征裂解碎片。本研究從茶芎中鑒別出苯酞二聚體類化合物12個(gè),包括化合物55、57、60～69。化合物61在正離子模式下得到m/z381.206 0的分子離子峰,分析確定化合物分子式為C24H28O4,在高能量轟擊下開環(huán),形成m/z191.107 1[M/2+H]+苯酞單體碎片離子,在此基礎(chǔ)上脫去一分子C2H4產(chǎn)生碎片m/z163.111 8[M/2+H-C2H4]+;苯酞單體開環(huán),脫去一分子H2O形成m/z173.095 9[M/2+H-H2O]+碎片離子,再脫去一分子CO產(chǎn)生碎片離子m/z145.101 4[M/2+H-H2O-CO]+(見圖3),與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的裂解方式基本一致,故推測(cè)化合物61為歐當(dāng)歸內(nèi)酯A。

圖3 歐當(dāng)歸內(nèi)酯A可能的質(zhì)譜裂解途徑

2.2 有機(jī)酸類

2.2.1 氨基酸類

氨基酸類化合物因含有氨基和羧基而易丟失NH3、HCOOH、CO2、H2O等中性分子產(chǎn)生一系列特征碎片。本研究從茶芎中鑒定出11種氨基酸,包括6種人體必需氨基酸(化合物4、8、16、17、19、21)和5種人體非必需氨基酸(化合物1、2、6、9、19)?；衔?1在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z205.097 2[M+H]+,其裂解過程為丟失一分子NH3形成m/z188.070 9[M+H-NH3]+,再丟失一分子H2O形成m/z170.060 1[M+H-NH3-H2O]+;或者丟失兩分子CO形成m/z132.080 6[M+H-NH3-2CO]+,再丟失一分子CH2形成m/z118.065 2[M+H-NH3-2CO-CH2]+;由[M+H]+丟失一分子HCOOH形成m/z159.091 6[M+H-HCOOH]+(見圖4),與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的裂解方式基本一致,故推測(cè)化合物21為色氨酸。

圖4 色氨酸可能的質(zhì)譜裂解途徑

2.2.2 有機(jī)酚酸類

有機(jī)酚酸類成分是茶芎中活血化瘀的主要藥效成分,該類成分多在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好,其裂解的方式主要有α裂解,以及中性CO2、CO、H2O分子的脫離。本研究從茶芎中鑒定出有機(jī)酚酸類化合物21個(gè),包括13、15、18、20、22～29、34～36、41、43、49、70～72。化合物22在負(fù)離子模式下得到m/z353.088 0的分子離子峰,分析確定化合物分子式為C16H18O9,通過α裂解得到碎片離子m/z191.057 1[M-H-C9H6O3]-,繼續(xù)脫去一分子H2O得到碎片m/z173.045 6[M-H-C9H6O3-H2O]-(見圖5),與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的裂解方式基本一致,故推測(cè)化合物22為綠原酸。

圖5 綠原酸可能的質(zhì)譜裂解途徑

2.3 生物堿類

本研究共鑒定出生物堿類成分5個(gè),包括化合物3、7、10～12,主要在正離子模式下以[M+H]+形式存在。化合物10在正離子模式下得到m/z245.077 0的分子離子峰,分析確定化合物分子式為C9H12N2O6,在高能量撞擊下,失去一分子C5H8O4,產(chǎn)生了m/z113.034 9[M+H-C5H8O4]+的碎片離子峰,繼續(xù)失去一分子OH,得到碎片離子m/z96.007 8[M+H-C5H8O4-OH]+,繼而脫去一分子CN得到碎片離子m/z70.028 6[M+H-C5H8O4-OH-CN]+(見圖6),與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的裂解方式基本一致,故推測(cè)化合物10為尿苷?；衔?2在正離子模式下得到m/z268.104 0的分子離子峰,分析確定化合物分子式為C10H13N5O4,在高能量撞擊下,失去一分子C5H8O4,產(chǎn)生了m/z136.062 0[M+H-C5H8O4]+的碎片離子峰,繼續(xù)失去一分子NH3,得到碎片離子m/z119.035 6[M+H-C5H8O4-NH3]+(見圖7),與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的裂解方式基本一致,故推測(cè)化合物12為腺苷。

圖6 尿苷可能的質(zhì)譜裂解途徑

圖7 腺苷可能的質(zhì)譜裂解途徑

2.4 其他類

本研究從茶芎中共鑒別出2個(gè)其他類成分,包括化合物5和化合物42?；衔?準(zhǔn)分子離子峰為m/z341.109 9[M-H]-,在高能量撞擊下,失去一分子C6H11O5,產(chǎn)生了m/z179.056 2的碎片離子峰,接著失去一分子H2O,形成m/z161.046 4[M-H-C6H11O5-H2O]-的碎片離子峰(見圖8),與文獻(xiàn)[25]報(bào)道的裂解方式基本一致,故推測(cè)化合物5為蔗糖?；衔?2正離子模式下形成質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子m/z163.038 8[M+H]+,預(yù)測(cè)其分子式為C9H6O3,連續(xù)脫去兩分子CO分別得到碎片離子m/z135.043 8[M+H-CO]+、m/z107.054 4[M+H-2CO]+(見圖9),與文獻(xiàn)[26,27]報(bào)道的裂解方式基本一致,故推測(cè)化合物42為傘形花內(nèi)酯。

圖8 蔗糖可能的質(zhì)譜裂解途徑

圖9 傘形花內(nèi)酯可能的質(zhì)譜裂解途徑

3 討論與結(jié)論

本研究采用正離子和負(fù)離子兩種離子化模式檢測(cè),通過保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片,對(duì)茶芎中的化合物進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定,結(jié)果從茶芎中共鑒定出72個(gè)化合物,其中苯酞類化合物33個(gè),有機(jī)酸類成分32個(gè)(包括11個(gè)氨基酸和21個(gè)有機(jī)酚酸類成分),生物堿類成分5個(gè),其他類成分2個(gè)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),茶芎中苯酞類和有機(jī)酸類成分種類最多,與現(xiàn)有文獻(xiàn)[16]報(bào)道的結(jié)果基本一致。

苯酞類化合物是一類具有苯酞結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物,是傘形科植物的特征性成分之一,在藁本屬植物川芎和當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸中廣泛存在[28],Han[15]總結(jié)現(xiàn)有研究成果發(fā)現(xiàn),川芎藥材中已分離鑒定出70余個(gè)苯酞類化合物;Zhang等[20]采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)從當(dāng)歸中鑒定出55個(gè)苯酞類化合物?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),苯酞類化合物具有防治心腦血管疾病、抗菌、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛和殺蟲等多種生物活性[28],例如,正丁基苯酞[29]、藁本內(nèi)酯[30]和洋川芎內(nèi)酯A[31]等成分可通過不同的機(jī)制保護(hù)大腦神經(jīng)元免受腦缺血的損傷。

有機(jī)酸類成分是一類分子結(jié)構(gòu)中含有羧基的化合物,在藥用植物中廣泛分布,主要富集于植物的根莖部位,如傘形科植物川芎和當(dāng)歸等,植物的葉和果實(shí)部位也有較高的含量。有機(jī)酸類成分可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的酸堿平衡、促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗炎、抗菌等,其中氨基酸類成分是人體必需營(yíng)養(yǎng)成分之一,能夠促進(jìn)機(jī)體新陳代謝,提高人體免疫力,如精氨酸有改善心腦血管疾病、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用[32];有機(jī)酚酸類成分具有抗氧化、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫等作用[33],如阿魏酸能夠延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間,減輕動(dòng)靜脈旁路模型大鼠血栓干、濕重,對(duì)血栓形成有明顯抑制作用[34]。

因此本研究建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法可以快速準(zhǔn)確且較全面地分析鑒定茶芎中的化學(xué)成分,為茶芎的質(zhì)量控制和藥效評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù),并為茶芎中其他未知組分的發(fā)現(xiàn)和鑒定奠定了基礎(chǔ)。然而,本研究也存在一些局限性,例如化合物的結(jié)構(gòu)推斷不夠準(zhǔn)確,沒有對(duì)特征性成分定量分析,沒有考慮化合物之間的相互作用與協(xié)同效應(yīng)等。基于此,未來的研究方向可從以下幾方面展開:優(yōu)化UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)的分析條件和參數(shù),提高茶芎中化合物的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度;利用其他的分析方法對(duì)茶芎中的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證和補(bǔ)充,如核磁共振、紅外光譜、紫外光譜等,提高茶芎中化合物的鑒定可靠性和完整性;對(duì)茶芎中的特征性成分進(jìn)行定量分析,建立茶芎的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)體系,反映茶芎中各種化合物的含量差異和相對(duì)貢獻(xiàn);結(jié)合藥理學(xué)和生物學(xué)的方法,探究茶芎中化合物的作用機(jī)制和相互作用,闡明茶芎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效成分組合等。