小鼠視神經損傷后神經節細胞和軸突數量的動態變化

沈冰燕，王敏，方葉楠，代琴，謝琪琦，吳文燦

1.溫州醫科大學 眼視光學院（生物醫學工程學院），浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬眼視光醫院，浙江 溫州 325027

外傷性視神經病變（traumaticoptic neuropathy, TON）又稱視神經損傷，主要是因顱腦及額面部遭受外力撞擊后直接或間接導致的視神經損傷，是一種重要的致盲性眼病，在頭面顱腦復合傷患者中的發病率為0.5%～5%[1-2]。因其損傷靶點明確、病程進展快等特點常作為視神經損傷研究的理想病種，目前尚無有效的治療方法[3]。既往研究[4-6]表明視神經損傷后軸突再生修復困難，視神經損傷導致軸突斷裂會引起視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells, RGCs）的凋亡[7-8]，且RGCs的損傷及丟失存在一定的時間累積效應，因此對于視神經損傷后不同時間點RGCs和軸突丟失情況的評估有利于治療時間的選擇。在本研究中，通過構建小鼠視神經鉗夾損傷（optic nerve crush,ONC）模型，探究視神經損傷后不同時間的RGCs和軸突數量的動態變化，了解視神經損傷的病理過程，從而進一步尋找視神經損傷后治療干預的適宜時機。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：20只SPF級健康C57BL/6J小鼠，1月齡，體質量12～15 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2018-0017。

1.1.2 藥品與主要試劑：鹽酸塞拉嗪注射液 （2 mL/支）購自長春華牧動物保健品有限公司；舒泰?20購自法國維克公司；復方托吡卡胺滴眼液購自邯鄲康業制藥有限公司；鹽酸丙美卡因滴眼液購自德國愛爾康公司；氧氟沙星眼膏購自沈陽興齊制藥有限公司；4%多聚甲醛購自北京蘭杰柯科技有限公司；曲拉通X-100（Triton-X100）購自北京索萊寶科技有限公司；山羊血清購自北京中杉金橋生物技術有限公司；封閉液配置：Triton-X1000.05 mL， 山羊血清0.5 mL，加9.5 mL 0.01 mol/L PBS；RBPMs抗體、山羊抗兔IgG抗體購自英國Abcam公司；2.5%戊二醛電鏡專用固定液購自福州飛凈生物科技有限公司；對苯二胺（PPD）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、丙酮與異丙醇購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器：顯微手術器械購自上海金鐘金屬制品廠；反向鑷購自瑞士Dumont公司；眼科手術顯微鏡購自德國徠卡公司；3D玻片掃描儀購自匈牙利3D HISTECH公司；活細胞轉盤共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司；小動物視網膜顯微成像系統購自上海輔光精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：1月齡C57BL/6J小鼠20只，隨機分為4組：一組為正常對照組，其余三組均為視神經損傷組，分別為左眼視神經損傷后3 d組、損傷后7 d組、損傷后14 d組，每組5只。

1.2.2 小鼠ONC模型的構建：損傷組所有小鼠經舒泰（175 mg/kg）及鹽酸塞拉嗪注射液（50 mg/kg）肌肉注射麻醉成功后，右側臥位置于手術顯微鏡的操作臺上。左眼為手術眼，10%碘伏常規消毒眼表與結膜囊，滴入鹽酸丙美卡因滴眼液行結膜角膜表面麻醉，鋪無菌洞巾，在顳側角鞏膜緣后約1.5 mm處用眼科剪剪開球結膜及下方筋膜組織，向后鈍性分離筋膜及肌肉，充分暴露后方的白色視神經。由同一位手術操作者使用反向鑷于球后1 mm鉗夾視神經10 s，眼表以及結膜囊內涂氧氟沙星眼膏，注意造模過程中避免損傷血管。手術操作后的動物一般狀況良好，眼部無感染，眼底照相以及視網膜光學相干斷層（optical coherence tomography, OCT）成像見視網膜正常或有輕微水腫表現，無白內障，無眼底出血者可視為造模成功，納入后續實驗。

1.2.3 視網膜全層與神經節細胞復合體（ganglion cell complex, GCC）層厚度測量：對正常對照組以及損傷后3、7、14 d的小鼠進行麻醉，雙眼滴入復方托吡卡胺滴眼液散瞳后，采用小動物顯微成像系統進行雙眼眼底照相以及損傷眼的OCT成像，OCT圖像以視乳頭為中心，分別進行水平掃描和環形掃描。利用insight軟件對OCT圖像進行半自動分層，分劃出GCC以及視網膜全層，利用軟件直接導出厚度數據。

1.2.4 小鼠視神經及視網膜取材：對正常對照組以及損傷后3、7、14 d的小鼠進行深度麻醉，頸椎脫臼法處死，切斷頭頸部，將頭放置在冰上，完全暴露白色視神經及視交叉，用眼科剪從視交叉前腳處離斷視神經，分別取出小鼠雙側眼球和左側視神經。

1.2.5 視網膜鋪片與組織免疫熒光染色：眼球利用1 mL針頭于角鞏膜緣穿孔，浸入4%多聚甲醛中固定12 h，用眼科剪沿著角鞏膜緣剪去角膜，去除晶狀體和玻璃體后，置入4%多聚甲醛中固定1 h，視網膜經5%山羊血清封閉液封閉12 h后，浸入以0.01 mol/L PBS按1:400稀釋的RBPMs抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。洗滌后加入1:400稀釋的山羊抗兔二抗，避光室溫孵育2 h，洗滌后將視網膜平均剪成四瓣，并展平置于載玻片上，自然干燥后封片，活細胞轉盤共聚焦顯微鏡下觀察RGCs的分布與數量。以視乳頭為中 心，將視網膜從內至外區域分劃三等分（紅色虛線圈）。在“四葉草”狀的視網膜上，每一瓣上的每一區域選定1 mm2面積區域（正方形）拍攝并計數RGCs數量。同一種顏色的正方形代表其所處于同一區域（見圖1），使用ImageJ軟件計數視網膜不同區域的RGCs數量。

圖1 小鼠視網膜鋪片區域分劃模式圖

1.2.6 軸突電鏡與PPD染色：取正常對照組及損傷組小鼠鉗夾損傷后3、7、14 d損傷灶部位的視神經，取材步驟同1.2.4，分別切成1.0 mm3大小的組織塊，4 ℃、2.5%戊二醛固定過夜，經0.01 mol/L PBS洗滌后，1%鋨酸避光室溫固定2 h，丙酮梯度脫水后，環氧樹脂包埋劑滲透包埋，制作視神經橫截面的超薄切片，每個組織連續切3～7片，PPD試劑利用等體積比的甲醇和異丙醇進行溶解，1% PPD溶液染色35 min，甲醇和異丙醇等體積混合溶液沖洗3 次，干燥后封片，用3D玻片掃描儀捕獲視神經橫截面圖像，每張切片選取5個獨立區域（見圖2A），使用ImageJ軟件進行分析，以獲得每個區域存活的軸突數和死亡的軸突數（見圖2B）。軸突存活率=存活的軸突數/（存活的軸突數+死亡的軸突數）×100%，5個區域的平均軸突存活率作為每張切片的軸突存活率，同一小鼠所有切片軸突存活率的平均值作為其軸突存活率。

圖2 小鼠視神經軸突計數示意圖

1.3 統計學處理方法采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗；GCC層厚度、RGCs數量及軸突存活率數據三者均符合正態分布，采用Pearson相關進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ONC后的活體觀察小鼠正常眼的視網膜呈淡紅色，視盤呈黃色，視網膜血管呈放射狀走行（見圖3A、圖3E-H）。ONC不同損傷時間點的眼底情況均未發現眼底出血或缺血情況（見圖3B-D）。

圖3 小鼠視神經損傷后不同時間點的眼底照相

2.2 小鼠視神經損傷后不同時間點視網膜與GCC層厚度變化根據小鼠視神經損傷后不同時間點損傷眼的OCT成像，測量并分析視神經損傷后不同時間點的視網膜與GCC層厚度變化（見圖4）。研究發現小鼠視神經損傷后3 d組的GCC層厚度與正常對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；視神經損傷后7 d組和14 d組的GCC層厚度較正常對照組和損傷后3 d組顯著變薄（P＜0.05）；小鼠正常對照組及視神經損傷后3 d組、損傷后7 d組、損傷后 14 d組，各組間的視網膜全層厚度差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 小鼠視神經損傷后不同時間點GCC層和視網膜全層厚度比較（每組n=5，±s，μm）

表1 小鼠視神經損傷后不同時間點GCC層和視網膜全層厚度比較（每組n=5，±s，μm）

與正常對照組比：aP＜0.05；與損傷后3 d組比：bP＜0.05；與損傷后7 d組比：cP＜0.05

組別GCC層厚度視網膜全層厚度水平掃描環形掃描水平掃描環形掃描正常對照組69.86±5.0371.75±2.37203.89±39.65249.60± 5.10損傷后3 d組69.02±1.8471.43±4.52216.43±33.19220.96±37.86損傷后7 d組60.92±3.28ab62.98±2.81ab235.68±11.75247.25± 9.39損傷后14 d組54.44±1.77abc55.66±1.88abc232.85± 6.09236.93± 5.31

圖4 小鼠視神經損傷后不同時間點的視網膜OCT成像

2.3 小鼠視神經損傷后不同時間點RGCs的丟失

RBPMs陽性細胞代表視網膜RGCs（見圖5）。與正常對照組相比，損傷后3 d組視網膜不同區域的RGCs數量，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，視網膜近視乳頭區域的RGCs數量在視神經損傷后7 d顯著減少（P＜0.05）；視網膜遠視乳頭區域的RGCs數量，視神經損傷后7 d組與正常對照組、損傷后3 d組相比顯著減少（P＜0.05）；損傷后14 d組視網膜不同區域的RGCs數量與正常對照組、損傷后3 d組、損傷后7 d組相比均顯著減少（P＜0.05），見表2。

表2 視神經損傷后不同時間點視網膜RGCs數量比較（每組n=5，±s）

表2 視神經損傷后不同時間點視網膜RGCs數量比較（每組n=5，±s）

與正常對照組比：aP＜0.05；與損傷后3 d組比：bP＜0.05；與損傷后7 d組比：cP＜0.05

組別近視乳頭區域中間區域遠視乳頭區域正常對照組239.60± 23.89235.60±46.95208.40±41.94損傷后3 d組285.20±110.17272.60±98.62223.00±73.95損傷后7 d組122.40± 33.10a128.80±27.95100.20±11.50ab損傷后14 d組44.40± 4.04abc44.40± 4.39abc38.40± 2.97abc

圖5 小鼠視神經損傷后不同時間點及不同區域的視網膜RGCs的RBPMs免疫熒光染色圖（標尺為50 μm）

2.4 小鼠視神經損傷后不同時間點軸突存活率與正常對照組相比，損傷后不同時間點的軸突存活率均顯著降低（P＜0.01）；且視神經損傷時間越長，軸突存活率越低，各不同損傷時間組間軸突存活率差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖6 小鼠視神經損傷后不同時間點的軸突存活率

2.5 小鼠視神經損傷后視網膜GCC層厚度、RGCs數量及軸突存活率之間的相關性分析同一只小鼠相同損傷時間的GCC層厚度（環形掃描和水平掃描）、RGCs數量以及軸突存活率三者之間均呈顯著正相關（P＜0.01），見圖7。

圖7 小鼠視網膜GCC層厚度、RGCs數量以及軸突存活率之間的相關性分析

3 討論

TON可以分為視神經原發性損傷和視神經繼發性損傷，視神經原發性損傷主要包括外傷時瞬間外力造成的改變、出血、視神經撕裂周圍結構如骨質對視神經的壓迫及視神經震蕩等，而視神經繼發性損傷的機制較為復雜，主要包括組織水腫、動脈血管的痙攣、循環障礙、炎癥反應對軸突的損害、RGCs的繼發性死亡等[9]。常用的用于建立視神經損傷的動物模型有小鼠、大鼠、兔和貓等[10-12]。其中，小鼠因價格便宜、易繁殖、視神經損傷容易操作、視網膜易分離且取材后完整性好等優勢，已廣泛用于視神經動物模型，因此在本研究選用小鼠作為實驗對象。

ONC動物模型是利用不同的夾持器械于球后夾持暴露的視神經，并注意避免眼動脈的損傷，該模型在視神經損傷的實驗研究上應用較多，與臨床上視神經挫傷較為接近，主要用于進行RGCs的存活和軸突再生方面的研究，具有易于操作、視神經鞘膜保持完整、損傷明確、無需開顱且創傷較小、術后動物存活率高等優點，但目前對于夾持力度大小、夾持時間并未形成統一的規范。不同操作者造成的視神經損傷程度難以保持一致，損傷程度難以精確定量，無統一的、可控制的標準[13-14]。本研究構建了小鼠ONC動物模型，由同一位手術操作者利用同一型號的反向鑷，在完整暴露視神經后，球后視神經1 mm處完全閉合夾持10 s，保持一致的夾持力度大小與夾持時間等，使得ONC動物模型的致傷程度相對一致。

RGCs的不可逆性損傷以及選擇性丟失是視神經損傷后出現的主要病理改變之一，較高的RGCs存活率有利于視神經損傷后軸突的再生修復[15]。RGCs計數也是目前公認的檢驗視神經功能的重要指標之一，因此在本研究中，通過視網膜鋪片結合免疫熒光染色對視神經損傷后不同時間點的視網膜RGCs進行定量分析，評估視網膜RGCs在ONC術后不同時間點的丟失情況。ONC后，RGCs的損傷及丟失存在一定的時間累積效應，RGC的定量分析是視神經損傷后對損傷程度進行量化觀察的良好指標。梅增輝等[16]通過觀察大鼠ONC后視網膜形態以及RGCs在不同時間點的計數變化，研究發現視神經損傷后視網膜形態結構發生改變，RGCs損傷的嚴重程度與損傷時間呈一定相關性，損傷3 d內RGCs數量幾乎不變，損傷3～7 d內為RGCs快速丟失期，7～14 d內為中速丟失期，14～28 d為慢速平穩減少期。本研究結果與之前文獻報道相一致，在損傷3 d內視網膜不同區域的RGCs數目幾乎不變，損傷后7 d和14 d，視網膜不同區域的RGCs與正常對照組相比顯著減少，說明在小鼠視神經損傷早期階段（損傷3 d內），視神經軸突損傷對視網膜RGCs胞體數影響作用小，而視神經長時間損傷會導致視網膜RGCs的顯著丟失。

視網膜及神經纖維層厚度的變化對于視神經損傷診療具有重要意義，研究[17]表明，神經纖維層變薄是視神經損害的敏感指標之一，甚至早于視野損害和視盤損害的發生。RGCs主要存在于視網膜的神經纖維層、神經節細胞層以及內叢狀層中，這3層結構統稱為GCC層。本研究中，因小動物視網膜成像系統的局限性，無法對神經纖維層單獨分層，因此通過對視網膜及GCC層厚度的測量進一步評估視神經損傷程度。研究結果發現，與正常對照組相比，視神經損傷后3 d組的GCC層厚度差異無統計學意義，損傷后7 d、14 d 組的GCC層厚度顯著變薄，且與RGCs數目丟失情況一致。但視神經損傷后不同時間點的視網膜全層厚度，各組視網膜厚度差異均無統計學意義。因此，我們認為GCC層的厚度改變可以作為評價視神經損傷的敏感指標之一，而視網膜全層厚度不能作為視神經損傷程度評價的有效指標。

因神經元的細胞體與軸突是一個整體，胞體和軸突之間常進行物質運輸和交換，視神經損傷后軸突中斷，軸漿雙向流動被阻斷，則視神經斷端近側和遠端及RGCs胞體都會受到影響[18]。且軸突作為ONC的直接對象，因此在本研究中，軸突的存活率也被作為評價視神經損傷程度的一個指標。研究發現，損傷早期視神經軸突存活率高，小鼠視神經損傷后3 d組的軸突存活率約為59.25 %，但隨著損傷時間越長軸突存活率越低。本研究結果發現，軸突存活率與GCC層厚度、RGCs數目的動態變化具有一致性，因此我們進一步對符合正態分布的GCC層厚度、RGCs數量與軸突存活率進行了Pearson相關性分析，結果表明GCC層厚度、RGCs數量與軸突存活率兩兩之間均呈顯著正相關。

綜上所述，小鼠ONC模型可以作為視神經損傷研究的動物模型，GCC層厚度、RGCs數量以及軸突存活率均可以作為評價視神經損傷程度的敏感指標。在小鼠視神經損傷早期階段（損傷3 d內），RGCs胞體以及軸突存活率高，因此早期及時干預治療有望預防視覺功能的進一步損害。而在視神經損傷中晚期（損傷后7 d至14 d），隨著損傷時間延長，RGCs胞體及其軸突存活數量逐漸減少，這可能是長時間視神經損傷的患者診療效果不佳的原因之一。但本研究僅為動物實驗，小鼠外傷性視神經的病理過程與人類自然疾病過程存在一定區別，因此有關視神經損傷患者其不同損傷時間點視神經損傷程度的評估，有待后續進一步研究。