依達拉奉右莰醇通過抑制氧化應激和提高自噬流促進周圍神經損傷修復

諶靖豪，樓承浩，魏圣哲，盧穎楓，余方正，王健

1.溫州醫科大學附屬第一醫院 創面修復科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 手外科·周圍神經外科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

周圍神經是指腦、脊髓以外的所有神經。由于周圍神經自身再生修復過程漫長，大多數患者在周圍神經損傷（peripheral nerve injury, PNI）后往往遺留有部分運動及感覺功能障礙[1-2]。依達拉奉右莰醇（Edaravone Dexborneol, C-EDA）是由依達拉奉與右莰醇以4:1的配比組成的藥物合劑。有研 究[3]發現，依達拉奉可以通過氧化應激傳感器核紅細胞因子2 相關因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2）和人銅鋅超氧化物歧化酶抑制肌萎縮側索硬化模型小鼠的氧化應激。右莰醇通過激活核轉錄因子κB信號通路在皮質神經元氧糖剝奪/再灌注損傷中發揮抗氧化和抗炎癥的保護作用[4]。兩種成分發揮協同作用，清除自由基與抑制炎癥反應，進而發揮更有效地調節內環境穩態的作用[5-6]。然而C-EDA在PNI方面的治療作用和具體分子機制鮮有學者進行過深入研究。氧化應激是體內氧化與抗氧化平衡作用失調的一種應激狀態，是自由基在體內產生的一種負面作用，被認為是導致衰老和機體疾病的一個重要因素[7-8]。在神經損傷后，氧化激活過度激活的過程會產生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）并積累，從而導致神經元死亡，這阻礙了神經結構及功能的恢復。有研究[9]發現外源性給予褪黑激素可以抑制PNI的氧化應激來增強PNI的恢復。自噬參與多種細胞內細胞器和蛋白質降解，是維持細胞生存環境穩態的重要過程[10]。有研究報道自噬的適度激活可以在順鉑誘導的螺旋神經節神經元損傷中發揮神經保護作用。然而自噬水平的增高并不完全代表自噬效應的增強[11]。自噬是一個動態的循環，這個循環稱之為自噬流[12-14]。本研究聚焦于C-EDA對PNI后神經的保護作用，以期探討C-EDA是否具有促進周圍神經修復的作用，并試圖探究其潛在的分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器大鼠神經絲蛋白200（neurofilament-200, NF-200）抗體購自美國Abcam公司（貨號：ab4680），髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein, MBP）抗體購自美國Abcam公司（貨號：b4066），亞鐵血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）抗體購自美國Proteintech公司（貨號：10701-1-AP），Nrf2 抗體購自美國Proteintech公司（貨號：16396-1-AP），SQSTM1（p62）抗體購自成都正能生物技術有限責任公司（貨號：382862），微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3（LC3II/I）抗體購自武漢ABclonal公司（貨號：A5618），Bcl-2抗體購自美國Proteintech公司（貨號：26593-1-AP），Bax抗體購自美國Proteintech公司（貨號：50599-2-1g），磷酸化AMP活化蛋白激酶（p-AMPK）抗體購自美國Abcam公司（貨號：#2535），轉錄因子E3（transcription factor E3, TFE3）抗體購自美國Proteintech公司（貨號：14480-1-AP），哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）抗體購自美國Proteintech公司（貨號：66888-1-Ig），GAPDH抗體購自成都正能生物技術有限責任公司（貨號：10494-1-AP），DAPI購自上海碧云天生物技術研究所（貨號：C1006），3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine, 3MA）購自美國MCE公司（貨號：HY-19312）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及給藥：40只SD大鼠按隨機數字表法均分為4組：①假手術對照組（Sham組）：實施麻醉與切開皮膚，并注射等量0.9%氯化鈉溶液；②PNI組：在10%水合氯醛麻醉后，用血管夾造成坐骨神經中度擠壓傷，并注射等量0.9%氯化鈉溶液；③C-EDA（C-EDA+PNI）組：麻醉后切開皮膚并使用血管夾夾閉坐骨神經，之后的4周每天腹腔注射3.75 mg/kg的C-EDA；④3MA組（PNI+C-EDA+3MA）：在制作PNI模型前3 d，以腹腔注射的方式每天給予mTOR抑制劑3MA（2.5 mmol/L）15 mg/kg來抑制自噬，麻醉后切開皮膚并使用血管夾夾閉坐骨神經，之后的4周每天腹腔注射3.75 mg/kg的C-EDA與15 mg/kg的3MA。術后4周處死所有大鼠，取右側坐骨神經進行病理指標評價。SD大鼠均購自溫州醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2021-0020。

1.2.2 步態印記分析：在術后第4 周對所有大鼠進行步態印跡分析[15]來評估運動功能的恢復。分別測量正常側后足（N）和損傷側后足（E）的3 個數據：足印長度、中間足趾寬度、足趾寬度。計算出的數值即為坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index, SFI）[16]。

1.2.3 神經電生理檢查：損傷后第4周使用神經電生理監測技術來評估坐骨神經傳導功能的恢復。具體操作如下：將神經電生理儀器的刺激電極放置于大鼠坐骨神經損傷部位靠近端1 mm處，接收電極放置于腓腸肌的肌腹。將平衡電極置于大鼠皮下，給予30 mA電流的電刺激，在神經電生理檢測儀上會得到相應的肌肉收縮波形。之后刺激電極位置改為神經損傷部位遠端1 mm處。同樣的刺激可以得到另一種波形。

1.2.4 免疫熒光染色：動物組織切片熒光：石蠟切片用二甲苯浸泡20 min。依次放入無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，用PBS洗5 min，重復3 遍。用高壓鍋加熱3 min后加入一抗：NF-200 （1:1000），MBP（1:2000），復溫1 h，加入二抗（1:1000），37 ℃孵育60 min，然后封片。使用DAPI標記細胞核。所有熒光圖像均使用激光共聚焦顯微鏡拍攝。

1.2.5 蛋白質印跡法（Western blot）檢測相關蛋白表達：提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。動物蛋白經過凝膠電泳、電轉移和封閉后，加入一抗孵育：HO-1（1:2000）、Nrf2（1:200）、p62（1:100）、LC3II/LC3I（1:200）、GAPDH（1:100）、Bcl-2（1:200）、Bax（1:200）、p-AMPK（1:100）、TFE3（1:200）、mTOR（1:200）、GAPDH（1:800）。二抗（1:1000）孵育1 h。使用電化學發光液浸泡膜，置于成像系統內進行圖像采集。Sham組的值默認為1進行比較。

1.2.6 脂質氧化物丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測：組織使用裂解液進行勻漿，10000～12000 r/min 離心10 min后取上清液用于后續測定。在離心管內加入0.1 mL PBS作為空白對照，加入0.1 mL不同濃度標準品用于制作標準曲線，加入0.1 mL樣品用于測定。隨后用酶標儀在532 nm波長下測定吸光度。

1.2.7 組織病理學觀察：將損傷側坐骨神經與腓腸肌置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察拍攝。

1.3 統計學處理方法采用GraphPad Prism 8.0 統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠后足足趾畸形程度比較從后爪伸展的足底視圖可以看出PNI組大鼠的損傷側后足與Sham組相比更加攣縮和畸形，C-EDA組大鼠后足的攣縮和畸形程度與PNI組大鼠相比更低，3MA組大鼠 后足的攣縮和畸形程度與C-EDA組大鼠相比更高，見圖1A。C-EDA治療4周后，PNI組的SFI值低于Sham組（P＜0.001），C-EDA組的SFI值與PNI組相比增高（P＜0.001），3MA組的SFI值較C-EDA組降低（P＜0.001），見圖1B。

圖1 術后4周各組大鼠的后足足趾形態變化及SFI比較

2.2 各組大鼠腓腸肌萎縮程度比較C-EDA治療4周后，雙側腓腸肌濕重（損傷側/健側）之比統計結果顯示，PNI組的腓腸肌濕重比值要遠低于Sham組（P＜0.001），C-EDA組的腓腸肌濕重比值較PNI組增高（P＜0.001），3MA組的腓腸肌濕重比值較C-EDA組減低（P＜0.001），見圖2A。腓腸肌HE染色結果顯示，PNI組的腓腸肌肌纖維面積要小于Sham組（P＜0.001），C-EDA組的腓腸肌肌纖維面積較PNI組增大（P＜0.001），3MA組的腓腸肌肌纖維面積較C-EDA組減少（P＜0.001），見圖2B。

圖2 術后4周大鼠腓腸肌萎縮程度比較

2.3 各組大鼠神經傳導速度比較神經電生理檢測結果顯示，PNI組的神經沖動潛伏期較Sham組明顯延長（P＜0.001），C-EDA組的神經沖動潛伏期與PNI組相比明顯縮短（P＜0.001），3MA組神經沖動潛伏期較C-EDA組延長（P＜0.001），見圖3。

圖3 術后4周各組大鼠神經電生理檢測結果與神經沖動潛伏期比較

2.4 各組大鼠坐骨神經HE染色結果比較為評價PNI組及C-EDA干預后神經纖維和髓鞘的組織學改變，在損傷后4周對各組神經縱、橫切片進行HE染色。縱切面染色顯示PNI組的神經纖維結構疏松、無序。C-EDA組神經纖維結構比PNI組更致密、均勻，3MA組的神經纖維結構與C-EDA組相比更加疏松、無序。橫切切片染色結果顯示，與PNI組相比，C-EDA組髓鞘形態完整，排列規則均勻，而3MA組與C-EDA組相比髓鞘形態破碎，排列紊亂。見圖4。

圖4 各組大鼠坐骨神經HE染色結果

2.5 各組大鼠坐骨神經免疫熒光染色結果比較坐骨神經橫縱切面NF-200和MBP免疫熒光共染色結果顯示，PNI組的NF-200的熒光面積明顯小于Sham組（P＜0.01），C-EDA組的NF-200的熒光面積明顯大于PNI組（P＜0.01），3MA組的NF-200的熒光面積明顯小于C-EDA組（P＜0.01）。C-EDA組的MBP的熒光面積明顯高于PNI組（P＜0.01），3MA組的MBP的熒光面積與C-EDA組相比降低（P＜0.01）。見圖5A、圖5B。

圖5 大鼠坐骨神經橫縱切面免疫熒光共染色圖像（刻度尺長度均為10 μm）

2.6 各組大鼠坐骨神經自噬相關蛋白表達的比較為了探究體內自噬和上述效應之間的關系，采用Western blot法檢測大鼠體內自噬相關蛋白LC3II/LC3I和p62的表達水平。結果顯示，PNI組的LC3II/LC3I的比值高于Sham組（P＜0.01），與C-EDA組相比差異無統計學意義（P＞0.05），3MA組的LC3II/LC3I的比值較C-EDA組降低（P＜0.01）。PNI組的p62表達水平高于Sham組（P＜0.01），C-EDA組的p62表達水平低于PNI組（P＜0.001），3MA組的p62表達水平較C-EDA組顯著增高（P＜0.01），見圖6。

圖6 Western blot法檢測自噬相關蛋白表達情況

2.7 各組大鼠坐骨神經氧化與凋亡相關蛋白表達的比較PNI組氧化應激的激活可能不利于神經纖維和髓鞘再生[17-18]。采用Western blot法檢測HO-1、核內Nrf2、Bax和Bcl-2的蛋白表達水平，結果顯示，與Sham組相比，PNI后HO-1和Nrf2水平略有升高（P＜0.05，P＜0.01）。而在使用C-EDA治療后，這一趨勢明顯上調（P＜0.05，P＜0.01），見圖7A。PNI組的促凋亡蛋白Bax水平高于Sham組（P＜0.001），而C-EDA組的促凋亡蛋白Bax水平較PNI組有所降低（P＜0.05）。PNI組抗凋亡蛋白Bcl-2的水平較Sham組降低（P＜0.001），使用C-EDA治療后Bcl-2的水平與PNI組相比有所升高（P＜0.01），見圖7A。統計分析結果顯示，與Sham組相比，PNI組的Bax/Bcl-2 的比值顯著升高（P＜0.001），使用C-EDA治療后，Bax/Bcl-2的比值顯著降低（P＜0.001），見圖7B。MDA檢測結果顯示，PNI組的MDA水平較Sham組顯著升高（P＜0.001），而在使用C-EDA治療后，體內MDA的水平顯著降低（P＜0.001），見圖7C。

圖7 各組氧化相關蛋白和凋亡蛋白表達水平和MDA檢測結果

3 討論

C-EDA是一種已在臨床上廣泛應用的處方藥物，由依達拉奉和右坎醇配比組成，依達拉奉具有抗氧化作用，而右莰醇具有抗炎作用，兩種組分協同增效，進而發揮更有效的神經保護作用。目前，大部分學者仍在深入探討C-EDA對腦缺血再灌注損傷等腦卒中疾病的治療機制，C-EDA所調控的的分子信號網絡逐漸清晰[19]。然而，在周圍神經相關疾病 中，鮮有研究報道C-EDA是否具有同樣的治療作用。

在中樞神經系統相關疾病中，已有學者通過研究證實C-EDA具有神經保護作用。ZHANG等[19]研究證實，C-EDA能夠通過激動絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1介導的絲裂原活化蛋白激酶抑制和激動Nrf2，抑制氧化應激、炎癥反應以維持微環境穩定，促進腦功能修復。目前，已有部分學者發現C-EDA對周圍神經也具有保護作用[20]。有研究[21]證實，大鼠周圍神經遭受缺血再灌注損傷時，C-EDA能夠抑制周圍神經缺血再灌注損傷慢性期活性氧的產生以及抑制炎癥反應，從而在缺血再灌注損傷后發揮周圍神經保護作用。

在本研究中，筆者在大鼠PNI模型中通過腹腔注射C-EDA來探討C-EDA對PNI修復的影響。研究中發現，C-EDA組的SFI值較PNI組降低，后足形態與PNI組相比也更為舒展。神經電生理檢測結果中，C-EDA組的動作電位潛伏期較PNI組有所縮短。C-EDA組的腓腸肌濕重比和HE染色肌纖維面積較PNI組顯著增高。表明C-EDA改善了神經支配肌肉的失神經營養狀態，從而改善了大鼠后足的攣縮程度以及改善了PNI后的神經傳導功能，減輕了PNI后腓腸肌的萎縮。此外，神經的HE染色結果顯示，與PNI組相比，C-EDA組的神經纖維結構更加緊密，排列更加有序，髓鞘形態更為完整。神經橫縱切片的NF200+MBP免疫熒光共染色結果顯示，C-EDA組的NF200以及MBP的熒光面積與PNI組相比增高，表明C-EDA治療可以促進PNI后髓鞘和神經纖維的修復。

自噬是體內主要的降解系統，它發生在細胞內，細胞內物質和異常細胞器由該系統被遞送至溶酶體并在溶酶體中降解[12]。有研究發現海藻糖通過不依賴mTOR的途徑增強自噬體募集，增強神經元中的自噬。增強的自噬通過內在的線粒體依賴性途徑抑制細胞凋亡，減少病變腔擴張和神經元死亡，并最終改善SCI后的功能恢復[22]。在PNI的早期階段，受損或功能失調的蛋白質、脂質和細胞器積聚在病變部位，產生局部應激，阻礙施旺細胞（Schwann cell, SCs）刺激神經修復的能力。調節PNI后的自噬，能夠清除病變部位積聚的功能失調的蛋白和細胞器等，從而促進SCs修復受損的神 經[23]。在本研究中，通過體內實驗發現損傷后明顯增強的自噬，在給予C-EDA后沒有明顯的改變。然而，C-EDA促進PNI后大鼠的后足形態、腓腸肌萎縮程度和神經傳導功能等運動功能恢復和神經、髓鞘的再生和修復以及下調體內外的凋亡水平，上述的治療效果在使用3MA抑制自噬后被逆轉。說明該自噬水平的升高可能是有利于神經的再生和修復的。然而相對于PNI組而言，C-EDA組的自噬水平沒有明顯的變化。有研究[24]發現增加自噬流可能是PNI的潛在治療靶點。自噬的目的不是簡單地消除物質，而是作為一個動態循環系統，這個動態循環稱為自噬流[12-14]。ISSA等[25]發現溶酶體膜蛋白可以上調自噬流，抑制帕金森病腦內過度的氧化應激，從而發揮神經保護作用和預防突觸核蛋白α誘發的帕金森病樣癥狀。故推測本研究中C-EDA的治療作用可能不只是來源于自噬活性的升高，更多的可能是因為通暢了自噬流。為了驗證這一推測，筆者檢測了體內外各組的自噬底物蛋白p62的表達水平。當自噬通暢時，作為自噬底物的p62會被消耗而水平降低。反之，自噬受阻時，p62的水平會升高，可以反映自噬的通暢性。結果顯示損傷刺激后p62水平顯著增高，在使用C-EDA治療后p62水平顯著降低，使用3MA抑制自噬后，C-EDA對下調p62水平的效應被逆轉。以上結果表明損傷刺激會抑制自噬流，而C-EDA治療能夠恢復損傷刺激抑制的自噬流。

氧化應激被認為是損傷后導致神經損傷的主要原因之一，不利于PNI后的神經功能恢復。氧化應激介導的神經元變性可以通過抗氧化防御的耗盡、微管破壞、脫髓鞘、神經炎癥、線粒體自噬損傷和細胞凋亡引起的神經元死亡來執行[26-28]。筆者猜?測C-EDA對于PNI后的保護和促恢復作用可能與其抑制過度的氧化應激有關。通過檢測抗氧化相關蛋白Nrf2（核內）、抗氧化酶HO-1以及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平。結果顯示，與PNI組相比，C-EDA組的Nrf2和HO-1表達水平增高，Bax水平降低，Bcl-2水平增高，Bax/Bcl-2比值降低。表明在PNI后，C-EDA能進一步提高體內的抗氧化水平和降低體內的凋亡水平來促進損傷神經的修復。

綜上所述，本研究首先證明C-EDA能夠促進PNI后神經纖維和髓鞘修復以及運動功能恢復，且C-EDA對于PNI后的治療作用與其能夠恢復損傷后受抑制的自噬流以及對抗過度的氧化應激密切相關。此外，C-EDA作為一種抗氧化活性物質可以抑制過度激活的氧化應激，為PNI的治療提供了一種新的可能。然而，本研究還未對C-EDA的抗氧化作用與增強自噬通量作用之間的聯系進行詳細研究，下一步研究重點為討論C-EDA的抗氧化應激作用與增強自噬通量作用之間的相互作用及其分子機制。