丹紅化瘀口服液中丹參素鈉及柚皮苷質(zhì)量研究

馮月娥 唐 清 匡艷輝＊ 張傳平

(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州510515)

丹紅化瘀口服液由成都中醫(yī)藥大學(xué)陳達(dá)夫教授根據(jù)王清任的“血府逐瘀湯”加減化裁研制而成，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國(guó)藥典》一部，為廣州白云山和記黃埔中藥有限公司的獨(dú)家品種，由丹參、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、柴胡、枳殼7味藥組成的復(fù)方制劑。7味藥配伍使用，具有活血化瘀，行氣通絡(luò)的功效；用于氣滯血瘀引起的視物不清、突然不見(jiàn)癥，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的吸收期見(jiàn)上述證候者[1-3]。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，丹紅化瘀口服液對(duì)糖尿病并發(fā)的視網(wǎng)膜病變有較好的保護(hù)作用，近幾年對(duì)其研究集中于臨床應(yīng)用方面[3-7]，而無(wú)檢索出對(duì)其質(zhì)量控制研究，目前對(duì)于丹紅化瘀口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究基礎(chǔ)較為薄弱。通過(guò)本課題組前期藥效學(xué)研究，在大鼠血漿中得到丹紅化瘀口服液的外源性化合物，其中主要為丹參中丹參素鈉等酚酸類和枳殼中柚皮苷、新橙皮苷等黃酮類兩大類指標(biāo)，他們可能是復(fù)方潛在真正的活性成分。

目前，該制劑的質(zhì)量控制方法主要為對(duì)薄層色譜法鑒別和原兒茶醛的含量測(cè)定[1]，而通過(guò)前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出，原兒茶醛在該制劑中極不穩(wěn)定，在藥品有效期內(nèi)降解較快，不適宜作為質(zhì)量指標(biāo)；另有學(xué)者研究柑橘屬中很多植物果中均含有柚皮苷，但是不含有新橙皮苷，不能準(zhǔn)確判定枳殼質(zhì)量[8]。因此，本文采用HPLC法對(duì)制劑中丹參素鈉、柚皮苷含量進(jìn)行測(cè)定，提高了質(zhì)量可控性，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：Dionex UltiMate 3000（美國(guó)戴安公司）、Waters 2695（美國(guó)沃特世公司）；色譜柱：WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Aglient Eclipse Plus C18。對(duì)照品丹參素鈉（批號(hào)：5781，純度97.5%）、柚皮苷（批號(hào)：5562，純度96.0%）均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。色譜甲醇、乙腈購(gòu)自默克（德國(guó)）制藥公司；屈臣氏飲用水購(gòu)自廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其他試劑均為分析純。丹紅化瘀口服液（批號(hào)為B19A001、B19A005、A19A002、D17A003、I19A007、K1 9A003、K19A004）均由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

丹參素鈉：采用WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶92）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)281 nm，柱溫為常溫，進(jìn)樣量10μL。

柚皮苷：采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.4%磷酸水溶液（18∶82）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm，柱溫為常溫，進(jìn)樣量10μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

丹參素鈉：取丹參素鈉適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 ml含0.560 2 mg的溶液，即得。

柚皮苷：取柚皮苷適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 ml含0.2 284 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

精密量取本品1 mL置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，使每1 mL溶液中含有0.1 mL本品，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

按丹紅化瘀口服液處方要求，分別制備不含丹參的陰性樣品、不含枳殼的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備丹參陰性對(duì)照溶液、枳殼陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、丹參陰性對(duì)照溶液、枳殼陰性對(duì)照溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（見(jiàn)圖1）。結(jié)果顯示，分離度良好，丹紅化瘀口服液中其他成分對(duì)2種指標(biāo)成分的測(cè)定無(wú)干擾專屬性良好。

圖1 丹紅化瘀口服液中2種成分HPLC圖

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.5μL、1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、15μl，注入液相色譜儀中，按“2.1”的色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪圖得丹參素鈉、柚皮苷回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 2種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.7 耐用性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別用Dionex UltiMate 3000、Waters 2695高效液相色譜儀和WondaSil C18、Aglient Eclipse Plus C18、Diamonsil C18不同型號(hào)的色譜柱對(duì)供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果表明不同儀器和色譜柱分離效果均無(wú)明顯差異，系統(tǒng)耐用性良好。

2.8 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，按“2.1”的色譜條件，連續(xù)6次進(jìn)樣，結(jié)果丹參素鈉、柚皮苷峰面積的RSD分別為0.83%、0.23%，表明方法精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份樣品，按“2.3”項(xiàng)下平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果丹參素鈉、柚皮苷平均含量的RSD分別為0.87%、0.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h、48 h進(jìn)樣，按“2.1”的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果丹參素鈉、柚皮苷峰面積的RSD分別為3.15%、1.33%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量同一批丹紅化瘀口服液共6份，分別精密加入適量對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，按“2.1”的色譜條件測(cè)定，計(jì)算丹參素鈉、柚皮苷的回收率。結(jié)果丹參素鈉、柚皮苷的平均回收率分別為95.07%、105.11%，RSD分別為0.74%、0.88%，（n=6）。結(jié)果見(jiàn)表2，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 丹紅化瘀口服液中2種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.12 樣品含量測(cè)定

取丹紅化瘀口服液樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中丹參素鈉、柚皮苷含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 丹紅化瘀口服液中2種成分含量

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

中藥制劑組分較多，其制備工藝繁雜，使其質(zhì)量難以得到較好的控制[9-10]。2015版《中國(guó)藥典》對(duì)丹紅化瘀口服液含量檢查為原兒茶醛，但通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)原兒茶醛在儲(chǔ)存期間，含量不穩(wěn)定，呈下降趨勢(shì)，時(shí)間越久，含量越低；另外，前期藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹紅化瘀口服液中主要的藥效成分為丹參素鈉等酚酸類和柚皮苷等黃酮類兩大指標(biāo)性成分。因此，選擇丹參素鈉和柚皮苷作為丹紅化瘀口服液指標(biāo)性成分進(jìn)行分析。

3.2 提取劑的選擇

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)不同溶劑（水、甲醇、80%甲醇、乙醇）進(jìn)行考察，綜合考慮所得色譜峰的峰面積、分離度、峰形和供試品制備時(shí)溶液是否產(chǎn)生絮狀物沉淀等方面，最終確定80%甲醇為提取溶劑。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)不同成分在紫外光下的吸收情況，本實(shí)驗(yàn)選擇最大吸收波長(zhǎng)以避免其他物質(zhì)干擾，保證測(cè)定準(zhǔn)確性，最終確定丹參素鈉和柚皮苷檢測(cè)波長(zhǎng)分別為281 nm（丹參素鈉）、284 nm（柚皮苷），此時(shí)色譜峰分離度、峰形理想，可用于定量分析。

3.4 流動(dòng)相的選擇

本次研究為單一成分定量考察，考慮到梯度洗脫比等度洗脫方法的建立和日常應(yīng)用更為復(fù)雜、困難，基線容易發(fā)生漂移等，選擇了等度洗脫。通過(guò)考察了不同比例甲醇/乙腈-磷酸水/甲酸水緩沖液系統(tǒng)，最終丹參素鈉、柚皮苷分別選擇甲醇-0.5%甲酸溶液（8∶92）、乙腈-0.4%磷酸水（18∶82）作為流動(dòng)相，此時(shí)色譜峰分離度、峰形均良好。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定丹紅化瘀口服液中丹參素鈉、柚皮苷的含有量，該方法簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，能夠有效地提高丹紅化瘀口服液質(zhì)量可控性，建議用于丹紅化瘀口服液的含量測(cè)定，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和完善提供科學(xué)依據(jù)。