兒童急性呼吸窘迫綜合征CD4+T細(xì)胞亞群格局及其影響研究

金載璇，吳 斌

兒童急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見的危急重癥，多由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等因素誘發(fā)，主要以難治性低氧血癥為特征。由于病死率較高，已成為嚴(yán)重威脅重癥患兒生命的主要原因。研究[1-2]表明，各種炎性細(xì)胞活化，導(dǎo)致促炎與抗炎因子的失衡，所誘發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)是ARDS產(chǎn)生的重要原因。其中，Th17/Treg細(xì)胞之間的平衡在免疫炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，ARDS病人肺泡灌洗能夠減少外周血中性粒細(xì)胞的凋亡，上述過程與腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-8、粒細(xì)胞集落刺激因子等促炎因子有關(guān)，調(diào)控著CD4+T細(xì)胞，Th17和Treg細(xì)胞的增殖、分化，而Th17、Treg細(xì)胞成熟并被激活后又進(jìn)一步產(chǎn)生相應(yīng)炎癥因子，促進(jìn)了ARDS的發(fā)生發(fā)展，上述過程形成了一個相互作用的炎癥網(wǎng)絡(luò)。因此，探討ARDS中CD4+T細(xì)胞的亞群及其功能對于影響ARDS的發(fā)生發(fā)展，緩解炎性損傷具有重要意義。

根據(jù)CD4+T細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子的類型及效應(yīng)的不同，可將其分為IFN-γ+Th1、IL-4+Th2、IL-17+Th17以及Foxp3+Treg。上述細(xì)胞因子在ARDS炎性反應(yīng)發(fā)病中的分布格局及貢獻(xiàn)度鮮見研究。本研究分析了CD4+T細(xì)胞亞群在ARDS中的格局變化，并評估了其在ARDS發(fā)病中的影響。現(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年3月至2019年10月我院兒科ICU收治的ARDS患兒61例，其中男37例，女24例；均符合2015年版“兒童急性呼吸窘迫綜合征：兒童急性肺損傷會議共識推薦”中制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，同時排除存在心力衰竭、肺動脈高壓、彌散性肺出血患兒，以及存在先天性遺傳代謝性疾病患兒。兒童ARDS(PARDS)新的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：(1)排除有圍生期相關(guān)肺部疾病的患兒；(2)發(fā)生在7 d以內(nèi)的已知臨床表現(xiàn)；(3)不能完全用心功能衰竭或液體超負(fù)荷來解釋的呼吸衰竭；(4)胸部影像學(xué)出現(xiàn)新的滲出性改變與急性器質(zhì)性肺損傷的表現(xiàn)一致；(5)在無創(chuàng)機械通氣時，面罩BiPAP或CPAP≥5 cmH2O，滿足P/F≤300或S/F≤264，可診斷PARDS；(6)在有創(chuàng)機械通氣時，滿足4≤氧指數(shù)≤8或5≤OSI<7.5，可診斷輕度PARDS；8≤氧指數(shù)<16或7.5≤OSI<12.3，可診斷中度PARDS；氧指數(shù)≥16或OSI≥12.3，可診斷重度PARDS。將ARDS患兒分為輕度(25例)、中度(20例)和重度(16例)。同時，選取同期同性別、同年齡的61名健康查體兒童作為對照組，對照組兒童身體健康，近1個月內(nèi)未發(fā)生感染、過敏性疾病，且沒有免疫抑制劑治療史，血、尿常規(guī)檢查均在正常范圍正常。ARDS組和對照組兒童性別與年齡分布見表1。所有研究對象的監(jiān)護(hù)人對本研究均知情同意，并簽署知情同意書，并經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)開展。

表1 ARDS組和對照組兒童性別與年齡分布

1.2 主要儀器和試劑 BD CantoⅡ流式細(xì)胞分析儀(BD公司)及其提供的配套試劑。

1.3 CD4+T細(xì)胞亞群的檢測 ARDS患兒入科病程第1天，健康體檢兒童按預(yù)約清晨抽取外周空腹肘靜脈血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作，避光孵育后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞絕對數(shù)量及Treg、Th17、Th1和Th2占CD4+T細(xì)胞的比例。

1.4 細(xì)胞因子的檢測 采用Real-timePCR檢測患兒CD4+T細(xì)胞亞群的標(biāo)志性細(xì)胞因子的表達(dá)。ARDS患兒入科病程第1天，健康體檢兒童按預(yù)約清晨抽取外周空腹肘靜脈血2 mL，置于生化管中離心分離血清，采用試劑微球代替紅細(xì)胞與細(xì)胞因子結(jié)合，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測患兒血清中IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F的水平。

1.5 危重評分評估 包含 10 項生理參數(shù)，總分 100 分，評分越低，患兒病情越危重，≤70分為極危重，>70～80分為危重，>80分為非危重[7]。觀察并記錄各組患兒額心率及收縮壓等指標(biāo)變化，評分越低，提示其病情程度越嚴(yán)重。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析和Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 ARDS患兒與對照組T細(xì)胞總量及Th1、Th2細(xì)胞的變化 與對照組比較，ARDS患兒T細(xì)胞總量、Th1、Th2均明顯升高(P<0.01)；3指標(biāo)在ARDS組不同程度之間的比較顯示，Th1指標(biāo)為重度高于輕度(P<0.05)，Th2指標(biāo)為重度高于中、輕度(P<0.05)和(P<0.01)，T細(xì)胞總量和Th1/Th2比例在不同程度組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 ARDS患兒與對照組T細(xì)胞總量及Th1、Th2細(xì)胞的變化

2.2 ARDS患兒與對照組Treg、Th17及Th17/Treg的變化 與對照組比較，ARDS患兒Th17細(xì)胞數(shù)量、Treg細(xì)胞和Th17/Treg比例均明顯升高(P<0.01)。3個指標(biāo)在ARDS組不同程度之間的比較顯示，均為重度的高于輕、中度(P<0.05～P<0.01)，輕、中度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 ARDS患兒與對照組Treg、Th17及Th17/Treg的變化

2.3 ARDS患兒與對照組CD4+T細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子的變化 ARDS組患兒中IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平明顯高于對照組(P<0.01)，而且隨著疾病程度的加重，4個因子的水平呈升高趨勢(P<0.01)(見表4)。

表4 ARDS患兒與對照組CD4+T細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子的變化

2.4 ARDS患兒外周血CD4+T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性 ARDS患兒外周血IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平與小兒危重病評分評分均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(rs=-0.933、rs=-0.910、rs=-0.946、rs=-0.930，P<0.01)。

3 討論

ARDS是指由嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等疾病誘導(dǎo)的肺組織出現(xiàn)彌漫性的炎性損傷及炎性水腫為主要病理特征的臨床危重癥。臨床可出現(xiàn)肺容積降低、肺順應(yīng)性下降、嚴(yán)重通氣/血流比例失調(diào)為主的進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫等表現(xiàn)。目前，ARDS發(fā)病機制尚不清楚，機體的促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的失調(diào)可能與ARDS的發(fā)病密切相關(guān)。當(dāng)機體受到各種因素刺激后，可導(dǎo)致炎性細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附，引起血管內(nèi)皮的損傷，最終產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子的釋放[8-9]，肺毛細(xì)血管通透性增加，肺組織發(fā)生炎性水腫等病理改變。但具體的炎癥調(diào)控機制尚不明確。CD4+T淋巴細(xì)胞亞群在多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用，本研究推測，ARDS的炎性因子損傷過程可能與CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的變化密切相關(guān)。

Th細(xì)胞在正常機體中處于前體狀態(tài)，當(dāng)受到外界特異性抗原的刺激下，可分化為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞兩個亞群，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α，參與機體的細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5及IL-6等，參與機體的體液免疫。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肺組織受到創(chuàng)傷、手術(shù)等外界刺激后，可出現(xiàn)以Th2為優(yōu)勢的Th1/Th2比例的失衡，導(dǎo)致以抗炎細(xì)胞因子分泌增多的免疫抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致機體IgE增高，氣道出現(xiàn)高反應(yīng)性，肺組織炎性損傷加劇。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，ARDS患兒T細(xì)胞總量、Th1、Th2均顯著升高，且Th2升高更顯著，Th1/Th2比例降低，且病情越重，Th1、Th2細(xì)胞變化越顯著(P<0.05～P<0.01)，同時，Th1、Th2細(xì)胞亞群的相關(guān)細(xì)胞因子也出現(xiàn)了相應(yīng)的趨勢，提示外周血Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞亞群可能參與了ARDS患兒的病理生理發(fā)病過程。

同時，Th17細(xì)胞亞群也是CD4+T細(xì)胞亞群的重要一員，參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性心肌炎等多種炎癥性疾病的免疫損傷過程[12-13]。Th17細(xì)胞具有強大的促炎作用，主要通過分泌IL-17、IL-21及IL-6等促炎細(xì)胞因子發(fā)揮作用。在TGF-β1和IL-6作用下，CD4+T細(xì)胞可被活化并轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞可促進(jìn)其主要效應(yīng)因子IL-17的分泌，促進(jìn)免疫應(yīng)答的發(fā)生，參與炎癥性腸病、哮喘、移植排斥等多種炎癥性疾病的病理過程。Treg細(xì)胞是發(fā)揮免疫抑制作用的T淋巴細(xì)胞亞群，主要通過分泌IL-4和IL-10等細(xì)胞因子發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的過程。研究[14]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3，促進(jìn)其向Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，同時，在TGF-β1在初始CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞中亦發(fā)揮重要作用，因此，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞存在相互轉(zhuǎn)化的分化過程，可影響對方的增殖、活化，二者之間的平衡直接影響著機體免疫功能的平衡狀態(tài)，炎癥的消散和吸收的過程。Th17/Treg平衡在慢性阻塞性肺疾病、兒童膿毒癥的發(fā)病中均發(fā)揮重要作用。本研究中，我們推測Th17/Treg在ARDS患兒中發(fā)揮重要作用，結(jié)果顯示，ARDS患兒Th17細(xì)胞數(shù)量顯著升高，Treg細(xì)胞降低，Th17/Treg比例升高，且病情越重，Th17及Treg細(xì)胞變化越顯著(P<0.05～P<0.01)，且相關(guān)細(xì)胞因子也出現(xiàn)了相應(yīng)的變化，提示Th17細(xì)胞在ARDS患兒發(fā)病過程中發(fā)揮了重要影響。

小兒危重病評分是評估為重癥患兒病情情況和疾病預(yù)后的重要指標(biāo)，在兒科領(lǐng)域被廣泛接受和采納，應(yīng)用于院前轉(zhuǎn)運、急診室救治、危重癥臨床研究等多種領(lǐng)域。本研究采用小兒危重病評分評分評估ARDS患兒病情，并與CD4+T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，ARDS患兒外周血IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平與小兒危重病評分評分之間呈顯著負(fù)相關(guān)。提示CD4+T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子可在一定程度上反映ARDS患兒的病情變化。