免疫檢查點HHLA2和PD-L1在肝癌組織中的表達及臨床意義

楊靜文，唐小童,郭 輝，朱 悅，張甜甜，劉 楊，吳 窮,汪 蕊

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，簡稱“肝癌”，是原發性肝癌最主要的病理類型，占原發性肝癌的75%～85%。2018年，全球范圍內肝癌發病率位于惡性腫瘤第6位，癌癥相關死亡第4位，給人類帶來了沉重的健康負擔[1]。我國是名副其實的HCC大國和重災國，約占全世界53.5%的比例，且致死率高達93%[2-3]。HCC起病隱襲，約80%病人在就診時即為晚期，失去了手術根治的時機。系統治療是無法切除的局部晚期和復發轉移性HCC的重要治療手段。盡管以索拉非尼為代表的多靶點小分子酪氨酸激酶抑制劑為晚期HCC帶來了希望，然而也只有中等程度的獲益。近些年，免疫檢查點抑制劑程序性死亡配體-1(programmed cell death protein 1,PD-1)/PD-L1(programmed cell death protein 1 ligand)單抗成為抗腫瘤藥物中的明星產品，已在多種實體瘤和血液系統腫瘤中都顯現了突出療效。免疫檢查點抑制劑在晚期HCC中臨床療效也備受關注，CheckMate 040 Ⅰ/Ⅱ期隊列研究表明PD-1單抗(納武單抗)對晚期HCC病人表現出良好的安全性及耐受性[4]。盡管PD-1單抗為部分晚期HCC病人帶來了持久的客觀緩解率，然而仍有部分人群無法從PD-1單抗治療中獲益，可能和肝癌存在其他免疫抑制機制有關。因此，深入研究HCC發生相關的免疫機制，探尋改善現有免疫靶向藥物療效的方法具有重要臨床意義。人內源性逆轉錄病毒-H長端重復相關蛋白2(HHLA2)是新近發現的B7家族免疫檢查點分子，在多種惡性腫瘤中高表達且與臨床預后不良相關[5]。因此，本研究通過免疫組織化學染色方法分別檢測免疫檢查點分子HHLA2和PD-L1在肝癌中的表達情況，并分析兩者表達相關性和與臨床病理參數及臨床預后的關系，進一步揭示肝癌發生的免疫機制，為探尋有效的免疫治療靶點提供依據。現作報道。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2012-2016年經手術切除的HCC病人石蠟組織樣本，其中90例HCC病人具有完整的病歷資料、生存隨訪資料和相對應的癌旁組織(距切緣>1 cm)。術前均未進行任何抗腫瘤治療。90例HCC病人中男74例，女16例，年齡31～78歲；腫瘤直徑≤5 cm 63例，腫瘤直徑>5 cm 27例；有血管侵犯 21例，無血管侵犯69例；按第7版AJCC的TNM分期標準：Ⅰ期58例，Ⅱ期29例，Ⅲ期3例。病理分級參考Edmondson法：Ⅰ級14例，Ⅱ級52例，Ⅲ級23例，Ⅳ級1例；手術樣本經10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋。

1.2 組織芯片的制定 每1例組織樣本，通過在 HE 切片確定典型癌及癌旁組織，之后在相應的蠟塊上作好標記，選擇20 mm×20 mm 孔徑的穿刺針，將組織按一定規則轉移至48 mm× 28 mm×15 mm 的蠟模中。混合 97.5 g萊卡石蠟和2.5 g蜂蠟(2.5%)后反復加溫溶解，冷卻后制成上述蠟模大小的空白蠟塊。在該蠟塊中內設計18×10點組織陣列，用組織儀打孔(1.5 mm)制成組織芯片(TMA)模塊。固定TMA 蠟塊，55 ℃ 溫箱放置 1～2 h，待蠟將要完全溶解前取出，室溫冷卻，使蠟與新插入的小圓柱狀組織融為一體，取蠟塊放置4 ℃冰箱保存備用。

1.3 免疫組織化學染色方法 TMA蠟塊4 ℃預冷 4 h，后放置-20 ℃條件下20 min，快速取出切片機修正切片，連續切片10～20張切片備用，切片厚度為4 μm。切片42 ℃溫水展開，貼至含多聚賴氨酸切片黏合劑的載玻片，晾干，62 ℃ 烤片儀烤片3 min，58 ℃繼續烤片18 h，-20 ℃保存備用。采用免疫組織化學EliVision法檢測HHLA2和PD-L1的表達，具體操作步驟依據試劑盒說明書進行。用已知的HHLA2和PD-L1陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。HHLA2(ab214327)多克隆抗體和PD-L1單克隆抗體(ab205921)均購自美國Abcam公司。

1.4 結果判定 HHLA2和PD-L1染色均定位于細胞膜和細胞質，細胞膜和細胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞染色，染色結果采用IHC半定量法進行分析，在高倍鏡下(×400)隨機取5個視野，計算每個視野下細胞的染色強度(I)和陽性染色細胞百分比(P)，取其平均值。免疫染色結果計算公式為H-score=I×P。HHLA2的I評分分別為：未見顯色染色(0分)；顯色染色為淺黃色(1分)；顯色染色為棕黃色(2分)；顯色染色為棕褐色(3分)。HHAL2的P評分分別為：0分為0%；1分為>0%～25%，2分為>25%～50%，3分為>50%～75%，4分為>75%～100%。HHLA2的結果判定為H-score 0分為陰性(-)，1 分弱陽性(1+)，2 分中等陽性(2+)，≥3 分的強陽性(3+)，H-score≥1分設定為HHLA2陽性[6]。PD-L1的I評分等級同HHLA2的I評分。PD-L1的P評分分別為：0分為0%，1分為>0%～10%，2分為>10%～50%，3分為>50%～100%。PD-L1的結果判定為H-score ≤1分為陰性(-)，2～3分弱陽性(1+)，4分中等陽性(2+)，≥6分強陽性(3+)，H-score≥3分設定為PD-L1陽性[7]。

1.5 統計學方法 采用配對χ2檢驗、成組設計χ2檢驗、Spearman 等級相關分析、Kaplan-Meier生存曲線法和Log-rank檢驗分析。

2 結果

2.1 HHLA2和PD-L1在 HCC組織中的表達 免疫組織化學染色結果顯示，HHLA2和PD-L1在HCC組織及癌旁組織中主要表達于細胞質與細胞膜中。HHLA2在HCC組織樣本中陽性表達率(49/90，54.4%)與癌旁組織(33/90，36.7%)差異無統計學意義(P>0.05)(見圖1)。HCC組織中PD-L1的陽性表達率(52/90，57.7%)與癌旁組織(44/90，48.9%)差異無統計學意義(P>0.05)(見圖2)。

2.2 HHLA2和PD-L1在 HCC組織中的表達的相關性 Spearman 等級相關分析發現，HCC組織中HHLA2 和 PD-L1 的表達呈正相關關系(rs=0.566，P<0.05)(見表1)。

表1 肝癌組織中HHLA2與PD-L1表達的關系

2.3 HHLA2和PD-L1的表達與HCC病人臨床病理參數之間的關系 結果顯示：HHLA2的表達與病人的年齡、性別、有無血管侵犯、病理分級及血清AFP水平無關，和臨床分期及慢性乙型肝炎感染有關(P<0.05)(見表2)。PD-L1的表達與HCC病人的年齡、性別、有無血管侵犯、慢性乙型肝炎感染及血清AFP水平無關，與臨床分期及病理分級相關(P<0.05)(見表2)。

表2 HHLA2 和PD-L1的表達與HCC臨床病理參數的關系(n)

2.4 HHLA2和PD-L1的表達與HCC病人臨床預后之間的關系 對90例肝癌病人不同HHLA2及PD-L1表達狀態的總生存時間進行Kaplan-Meier生存曲線分析，結果顯示：HHLA2陽性表達較陰性表達的肝癌病人中位總生存時間(mOS)差異無統計學意義[mOS:42個月vs 48個月，HR=1.481(0.928～2.362)，P>0.05]；PD-L1陽性表達的肝癌病人mOS同陰性表達的病人差異亦無統計學意義[mOS:43個月vs 53個月，HR=1.522(0.949～2.443)，P>0.05](見圖3)。

3 討論

HHLA2是最近被鑒定出的一種新的免疫檢查點分子，屬于B7家族新成員，免疫活性與B7家族具有相似性，也被稱為B7-H5和B7-H7[8]。人HHLA2基因位于第3染色體q13.13區，編碼一種包含了414個氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，同其他B7家族成員在氨基酸序列上有23%～33%的同源性。不同與其他B7家族成員，HHLA2胞外具有3個Ig結構域[9-11]。研究[10]發現，人外周血單核細胞表面表達HHLA2蛋白，IFN-γ和 LPS可誘導B細胞表面HHLA2的表達，T細胞表面不表達HHLA2蛋白。人大多數正常組織中不表達HHLA2，僅在胎盤滋養層細胞和腎臟、腸道組織、膽囊和乳腺上皮細胞少量表達。然而，多種惡性腫瘤細胞組織中存在HHLA2過表達的情況，且與病人的臨床預后相關。

研究[12]報道HHLA2高表達于三陰性乳腺癌組織中，且和淋巴結轉移與臨床分期密切相關。肺癌作為一種免疫原性腫瘤，卻只有約20%病人表達PD-L1或對PD-1/PD-L1檢查點抑制劑有治療反應。然而，HHLA2在66%非小細胞肺癌中表達，而在正常肺組織(包括肺泡型和Ⅱ型細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞)中未見表達。EGFR突變人群中HHLA2表達顯著增高[13]。因此，HHLA2免疫檢查點在不表達PD-L1的腫瘤中可能起到非常重要的免疫調控作用。高表達HHLA2的骨肉瘤病人表現出更差的生存預后[14]。此外，在腎透明細胞癌[15]，口腔鱗狀細胞癌[16]、肝內膽管癌[17]、膀胱尿路上皮癌[18]、胃癌[19]和結直腸癌[20]中均發現存在HHLA2過表達，且和臨床不良預后顯著相關。這些研究說明，HHLA2可能作為腫瘤新的免疫檢查點分子，參與腫瘤免疫逃逸過程，為腫瘤細胞生存提供機遇。

為了探索HHLA2在肝癌組織中的表達及其與PD-L1表達的相關性，本研究通過免疫組織化學染色方法考察了HHLA2和PD-L1在肝癌中的表達及其相關性，發現HHLA2蛋白在肝癌組織中的表達較癌旁組織中升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，PD-L1在肝癌組織中的表達較癌旁組織也未觀察到顯著差異(P>0.05)。本研究發現HHLA2的表達與臨床分期和慢性乙型肝炎感染有關。肝癌是炎癥相關性癌癥，腫瘤微環境(TEM)中，除了存在大量功能各異的基質細胞外，還存在其分泌的各種細胞因子，包括干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、轉化生長因子(TGF)-β等，它們對腫瘤的發生發展起到了重要作用[21]。研究已證實IFN-γ可誘導人單核細胞表面表達HHLA2[10]，因此，我們推測慢性乙型肝炎感染病人TEM中IFN-γ可能和肝癌細胞表面HHLA2高表達有關，其確證關系和分子機制需要進一步實驗證明。目前，關于HHLA2在肝癌中表達及與臨床預后的研究不多。國內學者李國等[22]研究報道，HHLA2在肝癌組織中高表達，且進展期和低分化肝癌組織中陽性表達率升高，提示HHLA2陽性表達與臨床分期和和組織分化程度相關。本研究結果同上述研究結果不一致，HHLA2是否參與了肝癌的發生過程以及能否成為肝癌免疫治療的潛在治療靶點仍需進一步探索。PD-L1在肝癌中的表達及其臨床意義研究較多，然而，PD-L1在肝癌中的陽性表達率差異較大，可能和抗體的選擇及判讀標準不一致有關。本研究考察了HHLA2及PD-L1在肝癌組織中表達的相關性，發現HHLA2與PD-L1的表達存在正相關關系，提示HHLA2可能協同PD-L1參與了肝癌的免疫逃逸過程。本研究未發現HHLA2和PD-L1的表達狀態與肝癌病人中位總生存時間之間的關系，HHLA2及PD-L1的表達是否為肝癌病人的預后相關因子還需要擴大樣本量繼續研究。

綜上所述，免疫檢查點分子HHLA2和PD-L1在肝癌組織中陽性表達率較癌旁組織有升高趨勢，兩者之間表達呈正相關關系，然而其表達狀態與肝癌病人生存時間無明顯相關。HHLA2是否能夠成為晚期肝癌未來潛在的免疫治療靶點仍需要進一步研究探索。