UQCRC1在結直腸癌組織中的表達及其與血清CEA的相關性

婁詩涵，汪強武，鄭海倫

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全世界常見的消化道惡性腫瘤之一。相關研究數據表明，近幾年我國CRC的發病率和死亡率均保持上升趨勢[1]。早期腫瘤病人可通過手術切除獲得良好預后，其5年生存率可超過90%。然而多數CRC確診時已為中晚期，無法達到理想的治療效果，5年生存率不到10%[2]。CRC中常常有代謝失常的表現[3]。泛醌-細胞色素c還原酶復合物核心蛋白1(ubiquinol cytochrome c reductase core protein 1，UQCRC1)是線粒體復合體Ⅲ的重要結構亞基之一，參與組成線粒體氧化呼吸鏈，對維持正常線粒體功能和細胞代謝有著基礎性作用[4]。國內外大量研究表明，UQCRC1在人類腫瘤中存在表達失調[5]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是目前應用最廣泛的腫瘤標志物之一，經常用于腸癌的檢測中。但因其特異性與敏感性欠佳，常與其他腫瘤標志物聯合使用[6]。本研究通過檢測CRC根治術后的組織標本中UQCRC1的表達，分析其和血清CEA的相關性，初步探討UQCRC1在結腸癌發生、發展過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2017-2018年蚌埠醫學院第一附屬醫院初診CRC手術切除得到的組織標本52例，并收集所選病例術前血清 CEA 值。其中男28例，女24例，年齡20～80歲。腫瘤大小：≤5 cm者27例，>5 cm者25例；組織學分型：腺癌49例，黏液癌3例；組織學分級：中分化及高分化共36例，低分化16例；TMN分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期22例，Ⅲ期20例，Ⅳ期8例；并從其中選取37例臨近癌旁組織作對照分析。納入標準：所有病人均已完善相關檢查(腸鏡活檢、臨床病理切片等)確診為原發性CRC，且為初診；術前未接受化療、放療、靶向及其他特殊抗腫瘤治療；所有病人均已在術前完善血清學CEA檢測。排除標準：合并其他系統腫瘤；合并急慢性嚴重炎癥、自身免疫性病；臨床資料不全者。診斷及分期標準：參照《中國CRC診療規范(2017 年版)》[7]中提到的診斷標準及TNM分期、組織學分級等。

1.2 實驗方法 本研究已通過本院倫理委員會批準。抗體UQCRC1購自美國Abcam有限公司(產品編號ab125882)，免疫組織化學采用SP法染色。按照試劑盒說明書進行染色程序，主要步驟包括：石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；自來水、蒸餾水各沖洗3遍；高壓抗原修復2 min；過氧化物酶阻斷10～15 min；蒸餾水沖洗3遍，PBS沖洗；加一抗溫箱孵育1 h，PBS沖洗3遍；滴加二抗，溫箱孵育30 min，PBS沖洗3遍；滴加DAB顯色3～5 min，自來水沖洗；蘇木精復染，水洗返藍；常規脫水透明，中性樹膠固定封片。

1.3 結果判定 以細胞質出現棕黃色顆粒為陽性。顯微鏡下觀察免疫組織化學染色結果，每張切片由本院2名病理科醫生采用下述方法評定[8]：標志物根據顯色深淺得到染色強度：0分(陰性)、1分(弱)、2分(中)、3分(強)；根據陽性染色區域相對于整個癌區百分比得到染色程度：<5%為0分、5%～25%為1分、>25%～50%為2分、>50%～75%為3分、>75%為4分。其結果為兩項得分乘積：最終得分≤2分為陰性，最終得分≥3分為陽性。血清CEA值參考值范圍為0～5 ng/mL,≥5 ng/mL即為陽性。

1.4 統計學方法 采用χ2檢驗、Spearman等級相關性分析。

2 結果

2.1 CRC組織中UQCRC1的表達和血清CEA陽性率 UQCRC1主要表達于細胞質(見圖1)。本次研究結果顯示，52例癌組織中有16例(30.8%)UQCRC1低表達；37例癌旁正常組織中UQCRC1呈低表達的有4例(10.8%)，在α<0.05的水準上，兩者差異具有統計學意義(χ2=4.94，P<0.05)。Spearman等級相關性分析結果提示UQCRC1的表達與組織性質顯著相關(r=-0.236,P<0.05)。CRC病人術前血清 CEA陽性率為40.4%(21/52)。

2.2 CRC組織中UQCRC1的表達與臨床及病理參數的關系 CRC組織中UQCRC1的表達與淋巴結轉移情況有關(P<0.05)，在病人不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、臨床分期上的表達差異均無統計學意義(P>0.05) (見表1)。

表1 CRC組織中UQCRC1的表達與臨床及病理參數的關系[n;百分率(%)]

2.3 CRC組織UQCRC1和血清CEA表達水平的相關性 52例結腸癌組織中，UQCRC1表達陰性同時CEA表達陽性者占62.5%(10/16)。運用Spearman等級相關分析得知，在α<0.05的檢驗水準上，CRC病人癌組織中UQCRC1表達水平與術前血清CEA值呈顯著負相關(r=-0.300)(P<0.05)(見表2)。

表2 CRC中UQCRC1、CEA表達的相關性(n)

3 討論

CRC是全世界絕大多數國家的一個健康問題。據報道，全世界每年有超過100萬人罹患CRC，遺傳和環境因素是CRC發生的重要條件[9]。在我國，CRC發病率逐年上升，且隨著一些危險因素如人口老齡化、不良飲食習慣等蔓延，其死亡率也處于明顯的上升趨勢[10]，居民生命健康受到嚴重威脅。盡早診斷和判斷癌變組織惡性程度對提高CRC病人的生存質量至關重要。

UQCRC1是一種核DNA編碼蛋白，是參與合成線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ的11個重要亞基之一。UQCRC1在胚胎存活和發育中起著關鍵作用，SHAN等[11]的實驗發現敲除雜合子小鼠中的UQCRC1導致胚胎致死。而關于UQCRC1的表達與惡性腫瘤中的關系，KULAWIEC等[12]發現74%的乳腺癌病人UQCRC1陽性，僅34%的卵巢腺癌病人UQCRC1表達。后陸續有關于其在食管癌、胰腺導管腺癌中上調，在賁門癌、胃癌中表達下調的報道[13-14]。從目前考慮的機制上看，不可忽視的是UQCRC1表達與線粒體的關系。研究[11]證實UQCRC1對維持酵母中復合體Ⅲ的完整性至關重要。有關實驗[15-16]顯示，上皮來源的細胞和小鼠精母細胞中UQCRC1的缺失可導致線粒體功能障礙。YI等[17]的研究指出，UQCRC1有助于在心肌損傷期間維持H9c2細胞的線粒體功能。根據這些證據可推測，UQCRC1的異常表達可影響到人類線粒體功能正常狀態的維持。正常線粒體功能中斷會導致多種人類疾病的發生，其中就包括腫瘤的發生[18]。近年來，線粒體出現在癌癥研究中的次數大大增多。線粒體可調節生物代謝，是癌細胞代謝變化的關鍵調節物[19]。目前線粒體功能障礙在多種癌癥的轉移進展中皆有報道發現[20]，如結腸癌、前列腺癌、胃癌等。線粒體障礙常產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，促進DNA損傷和遺傳不穩定性[21]。ROS是線粒體呼吸鏈產生的主要來源于復合體Ⅲ的具有損傷作用的副產物[22]，ROS失衡是線粒體功能障礙主要機制之一，其在癌癥的發生、發展和生存表型中皆發揮重要作用[19，23-24]。SHAN等[11]實驗還發現，UQCRC1缺乏致使小鼠線粒體膜電位和ATP產量下降，而ROS產量增加，可能原因在于UQCRC1的缺乏導致復合物Ⅲ活性的降低。

本實驗研究結果顯示，UQCRC1在癌組織中的表達下調率(30.8%)高于癌旁正常組織(10.8%)，差異有統計學意義(P<0.05)。UQCRC1參與組成線粒體氧化呼吸鏈，推測在結直腸細胞中UQCRC1的下調表達使細胞中的線粒體出現功能障礙，細胞能量代謝發生改變，進而導致腫瘤的發生發展。進一步分析該蛋白表達水平與腫瘤的大小、分化程度、臨床分期以及淋巴結轉移的關系，發現CRC組織中UQCRC1的下調表達與腫瘤淋巴結轉移有關，進一步提示UQCRC1的存在與CRC侵襲有著密切聯系。LI等[25]通過研究證實UQCRC1表達下調與血管內皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)表達升高之間存在正向相關關系，提出UQCRC1的下調可誘導VEGF-C的表達進而促進淋巴轉移。這一考慮基于有關VEGF-C通過誘導淋巴管的生成促使淋巴結轉移事件發生的相關報道[26]。

CEA是一種高分子糖蛋白，在人類的結腸、胃、汗腺等組織器官中存在。CEA在細胞的聚集、黏附、凋亡等過程中發揮作用，其與腫瘤的惡性程度密切相關。CEA增高可發生在多種惡性腫瘤中如胃腸道癌、乳腺癌、胰腺癌等，其中以結腸癌顯著[27-28]。研究[29]顯示CEA在CRC病人中的陽性率在40%～50%之間。此次研究結果顯示，CRC病人術前CEA陽性率為40.4%，UQCRC1表達與血清CEA表達存在負相關性。這種負向關系考慮原因為：在結腸細胞中UQCRC1的表達下調或缺失，使得細胞線粒體失去正常功能，細胞代謝環境改變使得組織器官更易受到損傷，從而導致腸道細胞癌變。隨著CRC的發生，CEA含量增多，充分發揮了其在腫瘤細胞免疫逃避及細胞聚集、黏附中的重要作用，使腫瘤細胞更易向周圍組織器官擴散和轉移[30]，進一步促進了癌癥的發展，使得UQCRC1的表達進一步下調。CEA作為標志物在腫瘤的檢測中應用廣泛，但因獨立檢測缺乏特異性，增加指標可使陽性可信度增加。本實驗結果顯示，CRC組織中UQCRC1表達陰性者其血清CEA陽性率明顯高于UQCRC1表達陽性者，表明聯合兩種指標檢測有助于評估結直腸腫瘤的狀態。

綜上所述，CRC中UQCRC1的表達下調與CRC的發生發展有密切關系，聯合UQCRC1和CEA兩個指標檢測可為CRC的診治及病情評估提供一定理論依據。