SCN4B/β4在鼻咽癌組織中的表達及意義

陶 露，韋卓利，武世伍，承澤農，江 浩，項 平

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種頭頸部常見惡性腫瘤，國際癌癥研究機構數據顯示，2018年全球新增NPC病例約有12.9萬例，約占全年診斷出的所有癌癥的0.7%，早期NPC病人的主要治療方法是放射治療[1-3]。晚期病人國家綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南建議放化療和輔助化療或誘導化療聯合治療[4]。研究[5]表明，晚期病人10年總生存率低于50%，經聯合治療的Ⅲ～ⅣA～B期病人30%以上發生遠處轉移，這也是鼻咽癌NPC病人致死的主要原因。電壓門控鈉離子通道β4亞基(SCN4B/β4)是鈉離子通道的阻遏蛋白，也是一種細胞黏附分子，對細胞聚集、浸潤、遷移等有作用[6]。BON等[7]發現在乳腺癌組織中SCN4B/β4對腫瘤細胞侵襲發揮作用。目前對SCN4B/β4在NPC組織中的表達與預后的關系尚未見相關報道，本研究檢測SCN4B/β4在NPC組織中的表達,分析其與臨床因素和預后的相關性，為尋找NPC預后生物標志物提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年6月至2014年7月收集90例在蚌埠醫學院第一附屬醫院治療的NPC病人，其中男51例，女39例，年齡27～75歲，病人均經病理檢查確診為鱗狀上皮細胞癌，臨床分期Ⅰ期18例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期30例，行病理檢查判定TMN分期、有無淋巴結轉移及有無遠處轉移等。所有病人臨床資料完整，并自愿提供NPC組織標本，活檢前均未接受過放療或化療，收集病人5年隨訪資料。此外，20份存檔的石蠟包埋正常鼻咽黏膜組織(主要為鼻咽黏膜慢性炎)標本作為對照組。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 試劑 SCN4B/β4蛋白多克隆抗體(Affinity Biosciences,USA)及ElivisionTMPlus免疫組織化學試劑盒(福州邁新)購自公司，SCN4B/β4蛋白為兔抗人原液，工作濃度1∶200。

1.2.2 方法 采用ElivisionTMPlus免疫組織化學法檢測SCN4B/β4蛋白表達情況，根據說明書操作:在10%甲醛溶液中固定NPC和非腫瘤性鼻咽組織標本，石蠟包埋后將其切成連續切片，厚度為3 μm。脫蠟和水化，經微波修復法在枸櫞酸鹽緩沖液中進行組織切片抗原修復。組織切片滴加第一抗體，室溫下孵育1 h或4 ℃過夜，PBS沖洗，浸入反應增強液，室溫下孵育20 min，PBS沖洗，滴加酶標抗兔IgG聚合物，室溫下孵育半小時，PBS沖洗，DAB顯色試劑顯色，DAB顯色試劑現配現用。終止顯色，蘇木精(福州邁新生物技術開發有限公司)重新染色(如有必要可用1%鹽酸乙醇分化)，PBS返藍，標本浸入梯度乙醇脫水，二甲苯清洗，中性樹膠封片(福州邁新生物技術開發有限公司)。用PBS代替空白對照組一抗、二抗，其余步驟同上。

1.2.3 結果判斷 顯微鏡下觀察NPC組織，SCN4B/β4主要在細胞膜、細胞質中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。評分標準如下：細胞膜無著色，為陰性(-)；任何比例細胞為微弱、不完整著色，為弱陽性(+)；>10%的細胞為完整但不均勻著色，呈弱至中等強度棕黃色，為陽性(2+)；>30%的細胞為完整著色，呈強棕褐色，為強陽性(3+)；其中，“-～+”定義為蛋白低表達，“2+～3+”定義為蛋白高表達[8]。

1.2.4 分期方法 按國際抗癌聯盟UICC分期第8版NPC分期標準對入組的NPC病人進行TNM分期[9]。

1.3 統計學方法 采用χ2檢驗、Spearman相關分析及Kaplan-Meier分析。

2 結果

2.1 SCN4B/β4蛋白表達與NPC臨床病理特征的關系 免疫組織化學結果顯示，與對照組相比，SCN4B/β4蛋白在癌組織中的表達明顯下調(見圖1)；SCN4B/β4蛋白在對照組中高表達率為85.0%(17/20)，在NPC組織中高表達率為30.0%(27/90)，差異有統計學意義(χ2=19.31，P<0.01)。

2.2 SCN4B/β4蛋白表達與臨床因素之間的相關性 SCN4B/β4蛋白在不同性別、年齡NPC中的表達差異無統計學意義(P>0.05)。SCN4B/β4蛋白表達在不同T分期、N分期、M分期、臨床分期差異有統計學意義(P<0.05～P<0.01)，T1～T2期、M0期、Ⅰ～Ⅱ期SCN4B/β4蛋白高表達率高于T3～T4分期、M1分期和Ⅲ～Ⅳ期，隨N分期增加，SCN4B/β4蛋白高表達率下降(見表2)。SCN4B/β4蛋白表達與局部浸潤、淋巴結轉移、遠處轉移和臨床分期有相關性(P<0.05)(見表3)。

表2 SCN4B/β4蛋白表達與臨床因素之間相關性[n；百分率(%)]

表3 SCN4B/β4蛋白表達水平相關性分析

2.3 SCN4B/β4蛋白表達水平與NPC病人預后分析 2017年6月至2019年7月進行電話隨訪，分析病人5年生存率。5年的總生存(OS)率為67.8%，臨床Ⅰ期為94.4%，Ⅱ期為93.3%，Ⅲ期為81.5%，Ⅳ期為30.0%(見圖2A)。SCN4B/β4高表達生存率為85.2%，SCN4B/β4低表達5年生存率為60.3%，高表達SCN4B/β4病人的5年OS率高于低表達SCN4B/β4病人(χ2=5.35，P<0.05)(見圖2B)。

3 討論

NPC是一種具高度侵襲性的上皮組織的惡性腫瘤，在特定地區如東南亞地區流行，尤其中國南方人群的NPC發病率和死亡率明顯偏高。SCN4B/β4基因定位于染色體11q23.33，含有5個外顯子，編碼228個氨基酸殘基構成的蛋白，β4氨基酸序列包括一個N端切除信號序列、一個細胞外5型免疫球蛋白樣(Ig)折疊、一個跨膜α螺旋和一個短胞內C端[10]。電壓門控鈉離子通道是在可興奮細胞中產生動作電位所需的跨膜蛋白，由一個α亞基和一個或幾個β亞基組成，其中β亞基(β1-β4)是調節細胞過程的重要多功能信號分子，如細胞黏附和細胞遷移[11]，與乳腺癌、前列腺癌及一些其他類型癌癥的侵襲和轉移行為有關。

侵襲性癌細胞具有重要的可塑性，使其能夠使用不同的侵襲模式，促進腫瘤生長和轉移的發展[12]。癌細胞的轉移能力取決于侵入細胞外基質(ECM)的能力，ECM是一種非細胞成分，由多種分子組成，包括蛋白質、糖蛋白和蛋白多糖，在許多類型的腫瘤微環境中受到異常調節，具有不同的物理和化學特性，可提供剛度、孔隙度和空間結構，可作為細胞遷移的載體，錨定或運動軌跡[13]。研究[14]證明，在未見成纖維細胞的腦腫瘤中，間充質干細胞樣細胞似乎參與ECM的重塑，并在腦腫瘤中提供侵襲性基質條件。SCN4B基因是可興奮組織中電壓門控鈉離子通道的輔助亞基，編碼β4蛋白并在正常上皮組織中表達，經乳腺癌組織活檢，原發性和轉移性腫瘤中的β4蛋白表達水平不同，敲低SCN4B基因的表達可促使RhoA通路活性增強，同時ECM降解活性保持不變，過表達細胞中β4蛋白的C端可阻止RhoA通路過度活化，從而降低癌細胞的轉移性[7]。本研究中，SCN4B/β4的高表達與TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移有一定的負相關關系，這也與上述SCN4B/β4抑制癌細胞轉移機制相符合。

研究[15]表明，檢測正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)組織中的SCN4B/β4蛋白表達水平，正常甲狀腺組織中SCN4B/β4蛋白陽性表達一般為中度，在所檢測的4例PTC組織中，SCN4B/β4蛋白低表達的僅2例，而剩下的2例中SCN4B/β4蛋白完全不表達，由此表明，在PTC組織中SCN4B/β4蛋白表達水平下調。在乳腺癌中，與正常組織相比，SCN4B基因在腫瘤和侵襲性癌細胞中的表達顯著降低，隨著侵襲性的增加(從Ⅰ級到Ⅱ級)，SCN4B基因的表達逐漸降低，在高級別腫瘤和轉移癌中幾乎完全不表達，過表達SCN4B基因，腫瘤的生長和發展及癌細胞的侵襲性明顯下調[7]。本研究中，NPC組SCN4B /β4表達水平明顯低于對照組，且NPC組SCN4B/β4蛋白高表達率低于對照組，這與上述結論一致。

研究[15]已證實，SCN4B/β4表達與PTC中的淋巴結侵襲和轉移有關，SCN4B/β4的表達在淋巴結轉移病例中顯著下調，生存數據分析顯示SCN4B/β4表達也與病人的預后情況有關，在典型的PTC亞型中復發概率最高，SCN4B基因在復發病例中表達明顯下調，SCN4B表達與復發率和淋巴結侵襲率呈負相關關系，無殘留腫瘤、低TNM分期和高SCN4B表達(作為分類變量)或增加的SCN4B表達(作為連續變量)與有利的無復發生存率相關。本研究也發現，TNM分期越高、有淋巴結轉移、有遠處轉移，NPC組織中SCN4B/β4表達越低。這與上述結論一致。本研究預后分析也顯示，SCN4B/β4低表達組5年生存率明顯低于SCN4B/β4高表達組，這說明SCN4B/β4高表達能明顯有利于NPC病人預后。

綜上所述，SCN4B/β4在NPC組織中表達下調，且其表達與TNM分期及預后相關，這些結果表明，SCN4B/β4可能在NPC的轉移中起重要作用，可能成為NPC預后的生物標志物。