三仁湯對脾胃濕熱證型胃癌癌前病變模型大鼠的作用機理

鄒先明 吳瑩 吳歡

摘要：目的?探究三仁湯對脾胃濕熱證型胃癌癌前病變模型大鼠關性的作用機理。方法?將50只健康清潔級SD大鼠視為研究對象，經數字隨機法分為隨機分為正常組、模型組、高劑量三仁湯組、中劑量三仁湯組和低劑量三仁湯組，總共5組，每組各10只，利用復合因素復制脾胃濕熱證癌前病變模型大鼠。采用免疫組織化學檢測法檢測P53、Bcl-2;采用原位末端標記法檢測細胞凋亡指數（AI）;采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素8（IL-8）、白細胞介素10（IL-10）和環氧化酶2（COX-2），并進行組間比較和分析。結果?在P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平方面，模型組要明顯高于正常對照組（P<0.05）;三仁湯（高、中、低劑量）組均明顯低于模型組（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯。在血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平方面，模型組要明顯高于正常對照組（P<0.05），三仁湯（高、中、低劑量）組均低于模型組（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯。結論?三仁湯對脾胃濕熱證型胃癌癌前病變模型大鼠關性的作用機理能表現為下調脾胃濕熱模型大鼠胃黏膜P53、P21ras、Bcl-2、AI、COX-2蛋白水平的，抑制血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10過度反應。

關鍵詞：三仁湯;脾胃濕熱證;胃癌癌前病變;炎性因子;細胞凋亡

中圖分類號：R285.5?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2020）11-0063-04

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of Sanren Decoction on gastric precancerous lesions in rats with spleen-stomach damp-heat syndrome. Methods： 50 healthy and clean SD rats were regarded as the research objects and were randomly divided into normal group， model group， high-dose， medium-dose and low-dose Sanren Decoction groups. 5 groups in total， 10 rats each group. The model rats were made by using compound factors to replicate precancerous lesion with spleen-stomach damp-heat syndrome. The immunohistochemical detection method was used to detect P53 and Bcl-2 and the in situ end labeling method to detect cell apoptosis index （AI）， enzyme-linked immunosorbent method （ELISA） to detect interleukin 1β （IL-1β）， leukocyte mediator Interleukin 6 （IL-6）， Interleukin 8 （IL-8）， Interleukin 10 （IL-10） and Cyclooxygenase 2 （COX-2）. The comparison and analysis were made among the groups. Results： In terms of levels of P53， Bcl-2， P21ras， AI， and COX-2， the model group was significantly higher than the normal control group （P<0.05） and Sanrentang groups （high， medium， and low dose） were significantly lower than the model group （P<0.05）. The medium-dose group had the most obvious reduction effect. In terms of serum IL-1β， IL-6， IL-8 and IL-10 levels， the model group was significantly higher than the normal control group （P<0.05） and the Sanrentang groups （high， medium， and low dose） were all lower than the model group （P<0.05）. The medium-dose group had the most obvious reduction effect. Conclusion： The mechanism of action of Sanren Decoction on gastric precancerous lesions in model rats with spleen-stomach damp-heat syndrome can be represented by down-regulating the gastric mucosal P53， P21ras， Bcl-2， AI， COX-2 protein levels in the model rats with the spleen and stomach damp-heat syndrome and inhibiting the overreaction of serum IL-1β， IL-6， IL-8 and IL-10.

【Key words】Sanren Decoction， spleen-stomach damp-heat syndrome， gastric precancerous lesions， inflammatory factors， cell apoptosis

胃癌是臨床最為常見的惡性腫瘤之一，好發于各個年齡段群體中，多以40歲以后群體為主，男性發病無明顯差異，具有較高的致死率，會嚴重威脅患者的生命安全。目前，臨床對于胃癌的治療并無特效手段，無論是手術治療，還是放化療，5年生存率均比較低[1]。研究顯示[2]，胃癌前病變的早期階段多見脾胃濕熱證。脾胃濕熱證與胃癌前病變的發病機制均與炎癥病變及細胞增殖與凋亡的失衡密切相關，炎癥可以改變癌基因和抑制癌基因的表達和轉化，促進細胞向惡化發展，炎癥因子能活化大多數細胞的生存信號，從本質上促成腫瘤的形成[3]。對胃黏膜癌前病變的臨床防治，目前西醫尚缺乏理想藥物和治療手段，中醫藥在此方面有獨特作用和明顯優勢。三仁湯是中醫學疾病治療的一種重要中藥方劑，其主要功能為清利濕熱，在治療濕熱初起方面有很強的功效。為此，本實驗探討三仁湯對脾胃濕熱證型胃癌癌前病變模型大鼠性作用機理，旨在為臨床提供一定的理論參考。現報道如下：

1?材料與方法

1.1?一般材料?實驗動物：健康清潔級SD大鼠50只，均購自南方醫科大學實驗動物中心，合格證號（SCXK（粵）2006-0015），體質量180～220 g，平均體質量（200.23±11.07）g。通過數字隨機表法分組，每組各10只。

三仁湯出藥方構成：杏仁15 g，制半夏15 g，薏苡仁18 g，飛滑石18 g，白通草6 g，白蔻仁（后下）6 g，竹葉6 g，厚樸各6 g。上述各藥物先用清水浸泡30 min，然后根據藥量：水量為1：8的原則煎煮3次，3次藥汁混合，離心取澄清藥汁。隨后進行藥物配制，三種濃度分別為0.41，0.82，1.64 g/mL，保存待用。

高糖高脂飼料：將12%豬油、8%蜂蜜與普通飼料融合加工（南方醫科大學實驗動物中心提供）。濃度為109/mL的大腸埃希桿菌液（細菌編號：44113-10，ATEC25992，中國微生物研究所提供）。

儀器設備：Avanti TM230 型 超 速 冷 凍 離 心 機（美 國BECKMAN 公司）;PL303 型電子天平（梅特勒托利多儀器<上海>有限公司）;SN-695 型放射免疫 r 計數測量系統（上海核輔光電儀器有限公司）;南方醫科大學公共衛生熱帶學院仿真模擬氣候倉（可以調節溫度、濕度、風速等）。

1.2?造模方法?正常對照組：采用普通飼料喂養，溫度和相對濕度分別控制為20～28 ℃、50%～60%的。

脾胃濕熱證大鼠模型組：采取“濕熱環境+高脂高糖飲食+白酒”法先建立脾胃濕熱證模型，再在此基礎上每日自由飲用N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）溶液+饑飽失常的綜合方法，造成胃黏膜上皮的中、重度不典型增生及不完全性腸化生，建立脾胃濕熱胃癌前病變大鼠模型。

三仁湯組：低劑量0.41 g/mL，中劑量0.82 g/mL，高劑量1.62/mL。在脾胃濕熱證大鼠模型的基礎上，移出置于自然環境12 h后開始灌服三仁湯煎劑，2 mL/200 g，每日1次，7 d后動物處死做相關檢查。

1.3?標本檢測?標本采集：大鼠處死前禁食12 h，用10%水合氯醛按0.7 mL/200 mg腹腔注射麻醉，迅速打開腹腔。經腹主動脈采血2 mL注入普通采血管待凝固后，在4℃環境下，放置3000 r/min條件下進行離心，持續10 min，靜置15 min后將上層血清分離，-20 ℃保存待檢。

采用免疫組織化學方法檢測 P53、Bcl-2、P21ras的表達，采用原位末端標記法檢測細胞凋亡指數（AI），采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素8（IL-8）、白細胞介素10（IL-10）和環氧化酶2（COX-2）。具體實驗步驟按照試劑盒說明書操作。

1.4?統計學分析?搜集、整理2組患者的上述數據，比如手術時間、術中出血量、住院時間等，采用統計學軟件（SPSS23.0版）進行統計、分析，對比操作實行χ2檢驗和 t檢驗，當P值在 0.05 以下時，提示差異存在統計學意義。

2?結果

2.1?各組P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平的比較?在P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平方面，模型組要明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;三仁湯（高、中、低劑量）組均明顯低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯。如表1所示。

2.2?各組血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10對比?在血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平方面，模型組要明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05），三仁湯（高、中、低劑量）組均低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯。詳情見表2。

3?討論

流行病學調查顯示，脾胃濕熱證多涉及消化系統，在消化系統疾病中較為常見，具有反復發作、復雜性高、治愈難度大等特點，其中脾胃濕熱證是慢性胃炎中醫分型的常見病型[4]。研究認為濕熱證可能是慢性胃炎向癌前病變及早期癌過度的病理階段[5]。有研究表明：脾胃濕熱證有癌變傾向[6]。三仁湯是中醫方劑經典方，其組成為杏仁、制半夏、薏苡仁、飛滑石、白通草、白蔻仁（后下）、竹葉、厚樸。現代實驗研究顯示：三仁湯中各單味藥物均有不同程度的抑制腫瘤作用，同時臨床有運用本方治療胃癌前病變濕熱內蘊證的報道，為本方用治脾胃濕熱胃癌前病變提供了一定的藥理學及臨床基礎。

脾胃濕熱證的病變中心為脾胃，脾胃的病變又以其功能病變為核心，而胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡之間的動態平衡又會對脾胃功能產生關鍵性的影響，若此種平衡被打破，極有可能引起脾胃功能病變。細胞凋亡是個體發育過程中由一系列基因控制的細胞主動死亡過程，在多數細胞類型中，基因Bcl-2與P53是重要的細胞凋亡調節因子，在細胞凋亡中相互聯系，相互作用，從而調控細胞凋亡[7]。本研究結果顯示，與正常對照組相比較，模型組P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平均明顯下降（P<0.05），表明了造模成功。進一步分析發現，三仁湯（高、中、低劑量）組均明顯低于模型組（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯，說明了三仁湯對脾胃濕熱證大鼠胃粘膜上皮細胞增殖與凋亡失衡的調節，可能通過下調增殖與凋亡相關P53、Bcl-2及COX-2 基因蛋白的表達實現。脾胃濕熱證以脾胃為病變中心，經過長期的臨床觀察和實驗研究表明：中醫的脾胃濕熱證與胃病、胃黏膜病理改變之間存在著非常密切的關系。研究顯示[8]，白細胞介素類是一族重要的細胞因子，其中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等均有一定的促炎性作用，濕熱證模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10含量的變化顯著，進一步說明濕熱證本質與炎癥及免疫病理關系密切。最新研究表明[8]：炎癥可以改變癌基因和抑制癌基因的表達和轉化，以促進細胞向惡性轉變。本研究結果顯示，與正常對照組相比，模型組血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平均明顯下降（P<0.05），說明造模成功。進一步分析發現，三仁湯（高、中、低劑量）組均低于模型組（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯，初步提示三仁湯治療溫病濕熱證諸癥的機制為調節血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 等炎癥因子在機體內的含量，降低炎癥反應程度，平衡免疫，提高治愈速度。

綜上所述，三仁湯可能通過下調脾胃濕熱模型大鼠胃黏膜P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2蛋白水平，糾正脾胃濕熱證大鼠胃黏膜上皮細胞增殖與凋亡的失衡，調節血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 等炎癥因子在機體內的含量，降低炎癥反應程度，從而促進胃黏膜損傷修復。本研究充分秉承三仁湯辛開苦降、燥濕泄熱、調達脾胃的組方理念，更深入挖掘經典方的科學內涵，為臨床推廣運用提供強有力的證據。

參考文獻：

[1]吳雨軒，莊麗維.胃癌相關基因的研究進展[J].醫學綜述，2018，24（5）：63-68.

[2]李秋晨，鄭勇，尚國臣，等.胃癌及胃黏膜癌前病變組織SSBP1表達臨床意義[J].中華腫瘤防治雜志，2018，25（5）：325-328.

[3]李云鵬，文小敏，武凱歌，等.三仁湯對脾胃濕熱證大鼠行為學及下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響[J].南方醫科大學學報，2010，12（1）：126-128.

[4]謝曉平，林阿豐，陳曉帆.胃癌前病變中醫辨證分型與Hp感染相關性的研究[J].云南中醫學院學報，2017，40（4）：60-62.

[5]季旭明，莊凌云，崔有利，等.三仁湯對濕熱證型病毒性肺炎小鼠模型的多靶點干預作用[J].中華中醫藥學刊，2019，12：213-214.

[6]劉寶珍.慢性萎縮性胃炎中醫證型與幽門螺桿菌感染、病理分級的相關性研究[J].現代中西醫結合雜志，2018，12（4）：612-614.

[7]魯香鳳，聶里紅，毛穎秋，等.慢性胃炎3種證型胃黏膜上皮細胞超微結構觀察[J].中華中醫藥雜志，2016，15（12）：5323-5328.

[8]顏勤.三仁湯對溫病濕熱證大鼠模型白介素及免疫球蛋白的影響[J].中國中西醫結合消化雜志，2017，22（9）：506-509.

（收稿日期：2020-06-22）