鳥綱類生物雞用于耳蝸毛細胞再生領域研究進展

萬良財

南方醫科大學珠江醫院耳鼻咽喉科(廣州 510282)

上世紀80年代，Cruz等為研究氨基糖苷類抗生素的耳毒性，以雞耳蝸為研究對象，研究發現雞耳蝸毛細胞在損傷后，具有較強自發再生能力，并因此開創了內耳毛細胞再生的新紀元[1]。此后，耳蝸毛細胞再生研究一直是耳科學界的熱點。雞作為鳥綱類動物的代表，因具有易于繁殖、胚胎期短、耳蝸取材方便及毛細胞再生能力較強等優點，一直是研究內耳毛細胞再生的理想動物之一。本文對雞耳蝸模型用于內耳毛細胞再生領域的研究現狀及進展綜述如下。

1 雞耳蝸解剖

雞耳蝸與哺乳動物耳蝸的外形大不相同，但功能相似，它是一條短而彎曲呈香蕉狀的管，由三部分組成：聽壺，屬前庭器官，與位覺斑相似；血管蓋，構成蝸管上壁及部分側壁，其間富含血管；聽覺感受器又稱基底乳頭(basilar papilla,BP)，呈鐮刀狀，位于上、下軟骨板之間，由基底膜、毛細胞、支持細胞構成。BP由近端向遠端逐漸增寬，近端尖銳，遠端圓鈍，凸側為神經緣，凹側稱非神經緣。其表面的毛細胞呈馬賽克圖案樣排列，毛細胞分為兩種類型，即高毛細胞與矮毛細胞。靠近神經部的毛細胞稱為高毛細胞，呈柱狀。靠近非神經部的毛細胞稱為矮毛細胞。高毛細胞類似于哺乳動物耳蝸的內毛細胞，而矮毛細胞則類似于哺乳動物耳蝸的外毛細胞，支持細胞有助于保持基底乳頭結構的完整性，維持網狀層離子屏障，以及新毛細胞的產生[2]。

2 雞耳蝸毛細胞損傷與再生研究

2.1 雞耳蝸毛細胞損傷模型的建立

2.1.1 噪聲性聾模型

Cotanche等最早利用10日大的雛雞暴露于聲壓級120 dB SPL的1500 Hz純音環境48小時構建噪聲性聾模型，在暴露后0 h，24 h，48 h，4 d，6 d和10d對其耳蝸進行透射和光學顯微鏡處理。研究發現毛細胞損傷呈現出兩種類型，第一種損傷毛細胞完全喪失，第二種毛細胞存活但表現出不同程度的靜纖毛損傷。噪聲暴露48小時后，在毛細胞喪失區域即出現新的毛細胞。暴露后10天，損傷毛細胞基本恢復[3]。此后，根據不同試驗需求，Co?tanche又將噪聲性聾毛細胞損傷分為中等程度與嚴重程度。以1500 Hz，120 dB SPL噪聲暴露24小時或以900 Hz，120 dB SPL噪聲暴露48小時可引起毛細胞中等程度損傷，即毛細胞損傷而不造成支持細胞損傷；而以1500 Hz，123 dB SPL噪聲暴露24小時或900 Hz 124 dB SPL噪聲暴露24小時不僅造成毛細胞嚴重損傷，同時也可造成支持細胞嚴重受損，即嚴重噪聲性損傷[4]。Kurian等利用噪聲暴露模型來研究毛細胞噪聲刺激后靜纖毛尖端連接改變，實驗時雛雞予0.9 kHz，120 dB SPL純音噪聲分別暴露4小時，24小時或48小時。研究發現矮毛細胞上靜纖毛尖端連接損失分別為30.3、40.6和35.5%。暴露48小時的雛雞予恢復24、96或288小時后，尖端連接可恢復至對照水平。高毛細胞尖端連接喪失與恢復與矮毛細胞類似[5]。Sliwinska-Kowalska等予120 dB SPL，每天暴露8小時，連續五天，或120 dB SPL連續暴露72小時成功構建了雞耳蝸毛細胞損害模型。研究發現，高強度噪音暴露可造成基底乳頭中部及近端毛細胞損壞，在基底乳頭中部毛細胞胞漿，支持細胞胞核和神經節細胞胞漿中均免疫表達生長因子bFGF及NGF[6]。

2.1.2 氨基糖甙類耳毒性模型

雖然氨基糖甙類藥物耳毒性機制目前尚不清楚，但予其制作耳毒性模型已廣泛應用于聽力學實驗研究。Xiang等為了探討新生毛細胞有抗硫酸卡那霉素耳毒性作用，對3日大小雛雞每天肌注硫酸卡那霉素（200 mg/kg），連續10-30日構建體外耳蝸毛細胞損傷模型，予掃描電子顯微鏡檢查基底乳頭。研究發現，基底乳頭新再生的不成熟的毛細胞具有一定的抗耳毒性能力，但隨著毛細胞的發育成熟則逐漸喪失了這種能力[7]。Shang等為了研究在耳蝸毛細胞損傷后，支持細胞是如何轉化為新生毛細胞的，體內試驗通過對5～10日大小的雛雞連續兩日皮下注射慶大霉素（250 mg/kg）；而體外試驗，以含78 μM鏈霉素DMEM或BME/EBSS培養基培養基底乳頭1～12日構建毛細胞損傷模型。研究表明，體內體外試驗，支持細胞有絲分裂和毛細胞分化的時間進程是類似的，支持細胞直接分化成毛細胞是毛細胞再生的一重要機制[8]。為了探討BMP4在內耳毛細胞再生中的作用，Lewis對7～10日大小的雛雞基底乳頭予含鏈霉素（172μM）DMEM體外培養，成功構建毛細胞損傷模型。研究發現，在毛細胞受損基底乳頭，BMP4可以抑制毛細胞再生，其原因可能是由于BMP4可以阻止ATOH1在支持細胞的聚集[9]。Jiang為研究毛細胞再生所涉及的候選基因和信號通路提供一個相對完整的數據庫，通過對6至8天大小的雛雞連續皮下注射慶大霉素(0.25 mg/g)兩天，造耳蝸毛細胞受損模型，通過RNA-Seq數據分析發現，在實驗組與對照組耳蝸，共發現有16588個基因表達，在注射后第3日，發現有805個差異表達基因[10]。最近，Wan等為了研究VEGF在耳蝸毛細胞再生中的作用，依據實驗不同，予含鏈霉素（172μM或1mM）兩種濃度DMEM培養4～11日大小的雛雞基底乳頭1～2天成功構建毛細胞喪失體外模型，研究表明，這兩種濃度在1～2日均幾乎可破壞全部毛細胞。支持細胞有絲分裂大多發生在開始給藥后的2～4日，少量新生毛細胞在開始給藥后的3～4日，至給藥后第8日，約有1/3再生毛細胞出現，此后，隨著時間延長，再生毛細胞數量可恢復至正常水平[11]。

2.1.3 鉑類藥物耳毒性模型研究

眾所周知，鉑類藥物具有耳毒性，予鉑類藥物制作耳毒性模型已用于鼠類及斑馬魚內耳毛細胞再生研究[12-14]。能否用順鉑來構建雞耳蝸毛細胞再生研究模型呢？Eric等予含10-20 μM順鉑培養基來孵育基底乳頭24小時，予3 μg/ml BrdU來監測支持細胞有絲分裂，發現基底乳頭毛細胞損害最早發生在遠端低頻區，從近端高頻區至遠端低頻區呈現一漸近加重獨特的調亡壞死模式。研究認為，支持細胞因治療后發生裂解調亡，不能通過增生或直接分化的方式而再生出新的毛細胞[15]。

2.2 雞耳蝸再生毛細胞的來源

Cotanche早期研究發現，在基底乳頭毛細胞受損后，支持細胞和排列在聽覺上皮非神經緣的透明細胞可以吸收外源核苷酸并進入S期，因此，認為這兩種細胞有可能是再生毛細胞的前體細胞。但隨后又排除了透明細胞作為再生毛細胞前體細胞的可能，因為透明細胞增殖和遷移到毛細胞受損區域后并不會形成新的毛細胞[4]。此后越來越多的研究者認為，在雞等鳥綱類動物，正常組織更新或毛細胞損害后產生新毛細胞的祖細胞是支持細胞[16]。Roberson在毛細胞再生的整個過程中加入3H-胸苷或溴脫氧尿苷，大量新再生的毛細胞并未標記3H-胸苷或溴脫氧尿苷，這說明這些未標記3H-胸苷或溴脫氧尿苷新再生的毛細胞并不是通過有絲分裂的方式轉化而來的[17]。此后，Stone課題組研究亦發現，正常情況下，基底乳頭不會出現增殖，但在毛細胞損害或消失后，支持細胞會再次進入S-階段和分裂。雞基底乳頭毛細胞再生是干細胞所驅動的過程，毛細胞可以通過支持細胞分裂增殖產生，也可通過支持細胞表型轉換（亦稱為“直接分化”或“非有絲分裂”）而產生。雖然有絲分裂和直接分化可以同時發生，但基底乳頭非神經部區域優先以直接分化再生新的毛細胞，在此區域約三分之一新再生的毛細胞表達溴脫氧尿苷（BrdU），亦即認為僅三分之一新再生的毛細胞是通過支持細胞有絲分裂而來的。支持細胞直接分化成毛細胞是毛細胞再生的一重要機制[8,18]。

2.3 雞耳蝸再生毛細胞的生理功能

為了研究再生毛細胞聽功能恢復情況，不同研究者對新生毛細胞畸變產物耳聲發射(DPOAE)、聽性腦干反應(ABR)及瞬態鈣離子電流等進行研究。Trautwein將雛雞暴露于525Hz純音，120dB SPL，48小時，比較暴露前后的DPOAE。研究表明，噪聲暴露不僅導致大量毛細胞喪失，還導致了基底乳頭神經部從低頻至中頻區域蓋膜破壞，雖然病變范圍局限，但DPOAEs所有頻率幅值在暴露后立即明顯降低。此后，高頻DPOAE可逐漸恢復到暴露前水平[19]。李勝利等對出生后16～20日雛雞按50mg/(Kg/d)肌注慶大霉素共10日后，間隔1、3、6、9和12日對雞耳蝸電位及聽覺腦干誘發電位進行測定。研究發現，在毛細胞損傷初期，耳蝸電位及聽覺腦干誘發電位明顯升高達80 SPL dB，但在慶大霉素注射9～12日，再生毛細胞已基本發育成熟，耳蝸電位及聽覺腦干誘發電位亦基本正常,說明毛細胞再生在聽功能恢復中起重要作用[20]。Ipakchi通過對雛雞及成年雞對比研究發現，在強噪聲暴露后，它們的耳蝸結構和功能都受到嚴重損害。對于雛雞，噪聲暴露雖會造成內耳損傷，在暴露后12天DPOAE完全恢復，暴露后2-4周，能恢復穩態的蝸內電位；但在成年雞，噪聲暴露對蝸內電位幾乎沒有影響，DPOAE在暴露后12天幾乎沒有恢復。研究認為，對于雛雞，12天足以充分修復內耳損傷，徹底恢復正常的DPOAE[21]。Levic等認為再生的毛細胞如要有正常毛細胞的生理功能，就必須要有正常的突觸和適度的離子電流表達。為了明確再生的毛細胞如何在成熟耳蝸中確立其功能生態位，Levic予慶大霉素治療后雞動物模型，誘導基底乳頭底部約1/3毛細胞損害。研究發現與成熟的毛細胞相比，新再生細胞可表現出與正常成熟毛細胞類似的瞬態鈣離子電流，這種電流在慶大霉素治療后7天再生的毛細胞最為明顯，且這種瞬態鈣離子電流可以誘導自發動作電位的產生[22]。

2.4 雞耳蝸毛細胞再生相關的基因及信號通路

通過研究終生具有再生功能的雞聽覺毛細胞的再生機制，有助于為哺乳動物尋找有效的干預靶點，解除阻斷毛細胞再生的機制，為最終解決哺乳動物內耳毛細胞再生提供重要的借鑒意義。迄今為止，啟動雞內耳毛細胞再生的精確信號機制尚不清楚，研究者普遍認為內耳毛細胞再生是一極其復雜的過程，涉及眾多的基因和信號通路，其中，Atoh1是被研究最多的轉錄因子，而Notch、EGFR、FGF、Wnt/b-catenin等信號通路一直是研究的熱點。

Cafaro等研究發現在基底乳頭毛細胞損害后，堿性螺旋環螺旋(bHLH)轉錄因子Atoh1被激活，進而進一步激活支持細胞通過分化或有絲分裂再生出新的毛細胞[18]。Lewis等研究發現，在基底乳頭毛細胞受損后，支持細胞Atoh1表達明顯上調[23]。BMP4可拮抗雞基底乳頭的毛細胞再生，其可能原因是通過阻止Atoh1在毛細胞前體細胞中的聚集[9]。Mulvaney等通過對雞Atoh1(cAtoh1)及鼠Atoh1(hAtoh1)進行比較，發現在克服Sox2抑制毛細胞分化方面，cAtoh1比hAtoh1更有效，cAtoh1能有效促進雞感覺毛細胞的分化[24]。Jiang研究發現，在基底乳頭毛細胞損害區域，支持細胞Atoh1表達上調；在毛細胞再生早期，支持細胞Sox2表達上調，但當支持細胞轉化為成熟的毛細胞后，這種上調便停止[25]。Daudet認為在正常雞基底乳頭，Notch信號通路相關基因如Notch1，Notch2與Ser?rate1 呈高表達，而Serrate2，Delta1，Atoh1，Hes5，Hes6，MINT和呈相對低表達，但當毛細胞喪失后，支持細胞Hes5與Delta1呈高表達。抑制γ分泌酶能促進Atoh1與Delta1的表達，降低Hes5的表達，這種改變并沒有明顯直接促進支持細胞進入細胞周期進行有絲分裂，但可促進支持細胞直接分化成新的毛細胞[26]。

White予經鏈霉素治療后的基底乳頭為研究對象，予AG1478抑制EGFR信號通路后，支持細胞有絲分裂明顯減少，且這種減少并不是因為支持細胞死亡而導致的。研究表明EGFR信號通路對促進支持細胞再次進入細胞周期十分重要，并有可能是通過下調p27Kip1而實現的[27]。Jacques以E5-E12大小基底乳頭為研究對象，研究發現，在發育中的基底乳頭，Wnt/β-catenin信號被激活，基底乳頭所有上皮細胞均表達β-catenin。予IWR-1抑制Wnt信號通路能明顯抑制細胞增殖，相反，以LiCl激活Wnt/β-catenin信號通路則能顯著增加毛細胞的數量，研究表明，Wnt/β-catenin信號在內耳毛細胞再生中起重要的作用[28]。楊思遠等以7日大小雛雞為研究對象，以鏈霉素對體外培養的基底乳突造成毛細胞損傷。研究發現，同時抑制Notch信號通路，激動Wnt信號通路，可使毛細胞的再生效果達到最佳狀態[29]。

近年來，為了從生物信息學角度來闡明內耳毛細胞再生機制，研究者應用RNA-Seq，cDNA微陣列等不同方法，調查雞內耳毛細胞受損后轉錄譜的改變[10,30]。Jiang通過對基底乳頭毛細胞再生過程中的基因表達進行高通量基因表達轉錄組分析，研究發現雞耳蝸表達16,588個基因，其中在不同組別中有1000個差異表達基因，這些基因涉及包括在胚胎發育過程中起重要作用的如Notch,MAPK(FGF),Wnt和TGF-b(BMP)等約100條信號通路，這為研究毛細胞再生所涉及的候選基因和信號通路提供一個相對完整的數據庫[10]。最近，Wan等利用RNA-Seq方法，發現雞基底乳頭經鏈霉素治療后，VEGF信號通路相關基因VEGFA,VEGFC,VEG?FR1，VEGFR2，VEGFR3表達上調，研究表明，在毛細胞受損后VEGF可以正向促進毛細胞再生，但其具體機制尚不明確[11]。

3 雞耳蝸在感音神經性聾的其它應用研究

HUANJU等對胚胎雞基底乳頭予鏈霉素治療后發現，E12和E14胚胎雞基底乳頭毛細胞幾乎不受影響，E16和E18胚胎雞基底乳頭，毛細胞有中等程度的損害，神經部的毛細胞對鏈霉素敏感，更易受到破壞。研究表明，與孵化后雞基底乳頭毛細胞不同，胚胎雞基底乳頭毛細胞對氨基糖苷類并不敏感，不易受到損害[31]。Tompkins以雞耳蝸毛細胞為研究對象，對尖端鏈接進行了深入地研究，研究發現尖端鏈接是毛細胞機械電轉導過程中必需的分子絲，尖端鏈接形成和靜纖毛長度控制是相耦合的。通過觀察各個尖端鏈接分子，并觀察它們如何相互作用、動態移動及觀察纖毛長度，深入地解釋了尖端鏈接的形成和異常鏈接修剪是如何發生的[32]。

4 小結

雞耳蝸因取材方便且毛細胞再生能力較強等優點，近40年來一直是研究內耳毛細胞再生的理想動物之一。目前，雞耳蝸毛細胞損傷實驗造模方法已十分成熟，通常包括噪聲暴露造模、氨基糖甙類造模。廣大研究者以雞耳蝸毛細胞損傷模型，對再生毛細胞的前體細胞，再生毛細胞的生理功能及內耳毛細胞再生的信號機制進行了深入地研究。自2011年以來，以美國聽力健康基金會（HHF）牽頭成立了第一個以研究內耳毛細胞再生的國際研究協會HRP(Hearing Restoration Project)，研究者分別以雞、鼠、斑馬魚三類不同動物為研究對象進行內耳毛細胞再生研究，比較不同物種內耳毛細胞再生機制異同，他們分工協作，數據共享，取得了一系列的研究成果，并將內耳毛細胞再生研究推向了一新的高度[11,33,34]。這也為雞作為研究耳聾的動物模型奠定了堅實的基礎，為豐富內耳毛細胞再生的內容，闡明耳蝸毛細胞再生的分子機制及今后治療因耳蝸毛細胞損傷造成的感音神經性耳聾提供重要的理論基礎。