滋陰明目丸對RCS大鼠視網膜Fas/FasL表達的影響

王英　蔣鵬飛　潘坤　彭俊　徐劍　彭清華

[摘要] 目的 觀察滋陰明目丸對RCS大鼠視網膜Fas/FasL表達的影響。 方法 選擇RCS大鼠，（1.51±0.27）月齡，共24只，按隨機數字表法將其分為三組：空白組、模型組、滋陰明目丸組（雌雄各4只，n = 8）。空白組：RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠，灌胃生理鹽水;模型組：RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠，灌胃生理鹽水;滋陰明目丸組：RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠，灌胃滋陰明目丸。灌胃30 d后，免疫組化染色觀察標本視網膜各層結構的形態學變化，Western blot法測定RCS大鼠視網膜Fas/FasL表達水平。 結果 免疫組化染色結果顯示：空白組大鼠視網膜各層結構清晰;模型組大鼠視網膜的厚度低于空白組，且各層結構不清晰;滋陰明目丸組大鼠視網膜厚度低于空白組但高于模型組，視網膜各層結構較清晰。Western blot法檢測結果顯示：滋陰明目丸組大鼠視網膜Fas、FasL蛋白相對表達量明顯低于模型組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 滋陰明目丸對視網膜的超微結構具有保護作用，能抑制視網膜上Fas/FasL的表達，從而減輕視網膜感光細胞的凋亡，達到保護視細胞的目的。

[關鍵詞] 滋陰明目丸;RCS大鼠;Fas/FasL;細胞凋亡

[中圖分類號] R774.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（a）-0025-04

Effects of Ziyin Mingmu Pills on the expression of Fas/FasL in the retina of RCS rats

WANG Ying1，2? ?JIANG Pengfei1，2? ?PAN Kun1，2? ?PENG Jun2，3? ?XU Jian1，2? ?PENG Qinghua1，2，3

1.College of Traditional Chinese Medicine， Hu′nan University of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha? ?410208， China; 2.Hu′nan Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Eye， Ear， Nose and Throat Diseases， Hu′nan Province， Changsha? ?410208， China; 3.Department of Ophthalmology， the First Affiliated Hospital of Hu′nan University of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha? ?410007， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Ziyin Mingmu Pills on the expression of Fas/FasL in the retina of RCS rats. Methods The RCS rats were selected， aged （1.51±0.27） months， total 24 rats， they were randomly divided into 3 groups： blank group， model group， Ziyin Mingmu Pills group （4 male and 4 female， n = 8）. Blank group： RCS （rdy+/+， p+/+） rats were given normal saline by intragastric administration; model group： RCS （rdy-/-， p-/-） rats were given normal saline by intragastric administration; Ziyin Mingmu Pills group： RCS （rdy-/-， p-/-） rats were given Ziyin Mingmu Pills by intragastric administration. After intragastric administration for 30 d， the morphological changes of each layer of the retina sample were observed by immunohistochemistry. The expression levels of Fas/FasL in the retina of rats were determined by Western blot. Results The results of immunohistochemistry showed that each layer of retinal structure of the rats in the blank group was clear; the thickness of retina in the model group was lower than that in the blank group and the structure of each layer of retina was not clear; the retinal thickness of Ziyin Mingmu Pills group was lower than that of blank group but higher than that of blank group， the structure of each layer of retina was clear. The results of Western blot assay showed that the relative expression of Fas， FasL protein in the retina of Ziyin Mingmu Pills group was lower than that in the model group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Ziyin Mingmu Pills has a protective effect on the ultrastructure of retina， which can inhibit the expression of Fas/FasL of the retina and reduce the apoptosis of retinal photoreceptor cells， thus achieving the purpose of protecting visual cells.

[Key words] Ziyin Mingmu Pills; RCS rats; Fas/FasL; Cell apoptosis

視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）又稱為色素性視網膜營養不良，是一種遺傳性視網膜感光細胞的退行性變，其遺傳方式有常染色體顯性遺傳[1]、隱性遺傳[2]及性連鎖隱性遺傳[3]等，性連鎖隱性遺傳較為少見，但視力損害最為嚴重。多數患者在青少年時期發病，發病隱匿，常有視網膜電圖（electroretinogram，ERG）異常[4]，初始癥狀僅有夜盲，繼而視野縮小，晚期僅殘留中央管狀視野，對患者生活質量影響較大[5]。RP的視力損傷主要與視網膜感光細胞的凋亡有關[6]，故本文以RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠為研究對象，通過觀察滋陰明目丸對RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠視網膜結構及凋亡相關因子的影響，探討其治療RP的生物分子學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物? RCS大鼠，SPF級，16只RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠，8只RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠，均雌雄各半，體重75～130 g，鼠齡（1.51±0.27）月齡，質量合格證號：2016 14068。RCS大鼠為遺傳性RP大鼠，廣泛用于RP的實驗研究[8]，RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠為已有RP大鼠，無需再次造模;RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠為未有RP病變大鼠。

1.1.2 主要儀器? 電泳儀（北京六一儀器廠）;輪轉石蠟切片機（徠卡）;臺式高速冷凍離心機（Thermo）;數碼醫學圖像分析系統（深圳市沅恒科技有限公司）;掃描儀（日本Canon）等。

1.1.3 主要試藥? 滋陰明目丸（湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科）;Fas（武漢默沙克生物科技有限公司，批號：kt54223，稀釋度1∶100）;FasL（武漢默沙克生物科技有限公司，批號：kt21599，稀釋度1∶100）。

1.2 實驗動物分組

將8只RCS（rdy-/-，p-/-）公鼠通過隨機數字表法分為模型組（4只）和滋陰明目丸組（4只）;8只RCS（rdy-/-，p-/-）母鼠同樣方法分為模型組（4只）和滋陰明目丸（4）只。空白組：RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠（8只）。

1.3 給藥方法

大鼠購回1周后進行灌胃，灌胃時間為30 d，每日灌胃1次。模型組和空白組灌胃蒸餾水（劑量：12 mL/kg）;滋陰明目丸組灌胃滋陰明目丸懸濁溶液（由滋陰明目丸溶于蒸餾水而成，劑量：7.8 g/kg）。實驗過程中動物的處理符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的實驗動物治療指導意見的規定。

1.4 取材方法

灌胃第30天結束后取材，麻醉RCS大鼠后，迅速摘取兩只眼球，處死大鼠，在顯微鏡下去除多余組織，分離視網膜備行HE染色和Western blot檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 免疫組化法觀察各組大鼠視網膜結構改變? 經浸蠟、脫蠟、洗蠟、復水組織切片、滴加Fas/FasL一抗、DAB溶液顯色、復染、脫水、封片等步驟，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.2 Western blot法檢測Fas/FasL蛋白表達情況? 經蛋白樣品制備、取上清液、測定蛋白質含量、凝膠電泳、顯色等步驟，凝膠圖像分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，進行正態性和方差齊性檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA），以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RCS大鼠視網膜組織結構

空白組：視網膜色素各層結構清晰（圖1A，封四）。模型組：視網膜結構不清，厚度低于空白組（圖1B，封四）。滋陰明目丸組：視網膜厚度低于空白組，高于模型組，視網膜結構較模型組清晰（圖1C，封四）。

2.2 各組RCS大鼠視網膜Fas/FasL蛋白表達情況

Fas蛋白表達情況：模型組蛋白表達最高，滋陰明目丸組次之，空白組蛋白表達最低。FasL蛋白表達情況：模型組蛋白表達最高，滋陰明目丸組次之，空白組蛋白表達最低。見圖2。經檢驗，各組Fas、FasL蛋白相對表達均符合正態分布，且方差齊性，行單因素方差分析結果顯示，各組Fas、FasL蛋白相對表達差異有高度統計學意義（P < 0.05），兩兩比較結果顯示，模型組Fas及FasL蛋白相對表達均明顯高于空白組（P < 0.01），滋陰明目丸組FasL蛋白相對表達亦明顯高于空白組（P < 0.01）;滋陰明目丸組Fas及FasL蛋白相對表達均明顯低于模型組（P < 0.01）。見表1。

3 討論

視網膜感光細胞是視覺形成的重要細胞[6]，而感光細胞的凋亡是RP視力下降的主要原因，感光細胞的凋亡受到相關基因的調控[7]。視網膜感光細胞很脆弱，一旦受損，便無法再生[8]。Fas/FasL系統介導的受體途徑是細胞凋亡的經典途徑之一[9]。FasL是Fas的天然配體，Fas與配體FasL結合后，通過一系列反應過程，引起細胞凋亡[10-13]。Fas/FasL系統在各類細胞凋亡中發揮重要作用，如腫瘤細胞[14-16]、組織缺血/再灌注損傷后的細胞凋亡[17]等。在視網膜各類細胞凋亡中，也有Fas/FasL系統的大量表達[18]，本研究發現滋陰明目丸組經過30 d灌胃治療后，視網膜Fas、FasL的蛋白相對表達明顯低于模型組，這提示在RP的感光細胞凋亡中，存在Fas/FasL系統的調控，而滋陰明目丸可以抑制Fas/FasL系統的表達，從而抑制視網膜感光細胞的凋亡。

RP屬于中醫“高風內障”范疇，其主要病機為本虛標實，虛中夾瘀，且血瘀貫穿RP的始終[19-24]。已有研究證實，存在RP的RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠具有“虛中夾瘀”證候[5，25-27]，這與RP的中醫病機一致，故在臨床上治療RP可取得較好的療效。

本研究發現滋陰明目丸可以抑制RP大鼠感光細胞的凋亡，其機制可能是抑制了Fas/FasL系統調控的凋亡途徑，從而改善視網膜組織結構和視功能。

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（收稿日期：2018-10-12? 本文編輯：張瑜杰）