超聲腫瘤體積倍增時間與乳腺癌腫瘤增殖/侵襲分子表達的相關性

韓彥峰　鄒淑偉　王寶華

[摘要] 目的 探討超聲腫瘤體積倍增時間（TVDT）與乳腺癌腫瘤增殖/侵襲分子表達的相關性。 方法 選取2016年12月～2018年6月于浙江省臺州市中西醫結合醫院（以下簡稱“我院”）就診的85例乳腺癌患者作為研究對象，另選取我院同期病理確診的56例乳腺腺瘤患者。患者應用三維超聲進行檢查，計算TVDT，并對乳腺癌、乳腺腺瘤患者病理學相關指標進行統計學分析。 結果 乳腺癌腫瘤病灶TVDT水平均明顯低于乳腺腺瘤患者（P < 0.05），且浸潤性導管癌患者腫瘤TVDT水平明顯低于導管內原位癌患者（P < 0.05）;乳腺癌患者腫瘤組織中促增殖基因、抗增殖基因、促侵襲基因、抗侵襲基因與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）;Pearson檢驗發現乳腺癌病灶TVDT水平與增殖、侵襲相關基因表達水平具有密切關系（|r|≥0.5，P < 0.05）。 結論 乳腺癌患者可出現TVDT水平異常降低現象，且其降低程度與乳腺癌患者增殖、侵襲相關基因的表達活性具有密切聯系，因此基于TVDT水平可實現乳腺癌患者治療效果及預后結局的初步評估。

[關鍵詞] 超聲腫瘤體積倍增時間;乳腺癌惡性分子;血管密度;相關性分析

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（a）-0133-05

Correlation between ultrasound tumor volume doubling time and breast cancer tumor proliferation/invasion molecule expression

HAN Yanfeng1? ?ZOU Shuwei2? ?WANG Baohua3▲

1.Department of Ultrasound， Taizhou Integrated Chinese and Western Medicine Hospital， Zhejiang Province， Taizhou? ?318000， China; 2.Department of Ultrasound， Wenling Women′s & Children′s Hospital， Zhejiang Province， Wenzhou? ?317500， China; 3.Department of Ultrasound， the First Affiliated Hospital of Zhejiang University， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310006， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between ultrasound tumor volume doubling time （TVDT） and breast cancer tumor proliferation/invasion molecule expression. Methods From December 2016 to June 2018， 85 patients with breast cancer were selected from Taizhou Integrated Chinese and Western Medicine Hospital Zhejiang Province （"our hospital" for short）. Another 56 patients in our hospital with breast adenoma diagnosed by pathology were selected. The patients were evaluated by three-dimensional ultrasound and TVDT was calculated. The pathological indexes of breast cancer and breast adenoma were analyzed statistically. Results The level of TVDT in breast cancer tumors was significantly lower than that in breast adenomas （P < 0.05）， and the level of TVDT in patients with invasive ductal carcinoma was significantly lower than that in patients with ductal carcinoma in situ （P < 0.05）. The proliferation-promoting genes， anti-proliferative genes， invasive genes， and anti-invasive genes were significantly different from the control group （P < 0.05）. Pearson test showed that the level of TVDT in breast cancer was closely related to the expression of genes related to proliferation and invasion （|r| > 0.5， P < 0.05）. Conclusion Abnormal TVDT levels may occur in patients with breast cancer， and the degree of reduction is closely related to the expression of genes involved in proliferation and invasion of breast cancer patients. Therefore， based on the level of TVDT， the therapeutic effect and prognosis of breast cancer patients can be evaluated.

[Key words] Ultrasound tumor volume doubling time; Malignant breast cancer molecules; Vascular density; Correlation analysis

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤疾病之一，其主要發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。病理生理學研究[1]顯示，由于乳腺是非直接參與人體生命活動的必須器官，因此乳腺癌本身并不會直接威脅患者生命，但由于胸部具有豐富的血管與淋巴管，因此乳腺癌極易發生周圍侵襲與遠處轉移，進而導致患者預后不佳或死亡。早期診斷與治療是改善乳腺癌患者預后結局及降低死亡率主要的方法，傳統輔助檢查技術為灰階超聲、多普勒超聲及超生造影檢查，但其在鑒別良惡性、血管評估、治療指導、預后評價等方面仍存在一定的局限性[2]。超聲腫瘤體積倍增時間（TVDT）是一種客觀評價腫瘤自然生長率以及生物惡性能力的新型超聲檢查方案，其在乳腺癌的輔助診斷以及病情評價中具有一定的臨床價值[3]。本研究通過對乳腺癌及乳腺腺瘤患者進行超聲TVDT檢查，探討TVDT與乳腺癌惡性分子表達及血管內皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年12月～2018年6月于浙江省臺州市中西醫結合醫院（以下簡稱“我院”）就診的85例乳腺癌患者作為研究對象，另選取我院同期病理確診的56例乳腺腺瘤患者。乳腺癌患者年齡39～68歲，平均（52.7±4.8）歲;病程6個月～5年，平均（2.5±0.8）年;未婚19例，已婚66例;生育史42例;病理證實導管內原位癌38例，浸潤性導管癌47例。乳腺腺瘤患者因乳腺無痛性腫塊就診，年齡28～69歲，平均（49.5±8.1）歲;病程2～9年，平均（4.8±1.1）年;未婚21例，已婚35例。納入標準：①已簽署知情同意書;②已通過我院醫學倫理委員會審核;③經組織病理學明確診斷為乳腺癌、乳腺腺瘤;④均避開月經期檢查或在月經后1周進行檢查;⑤初診初治患者。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤;②其他臟器功能不全;③嚴重精神疾病;④嚴重心腦血管疾病;⑤自身免疫系統疾病;⑥妊娠期或哺乳期女性;⑦合并全身急慢性感染。

1.2 研究方法

1.2.1 超聲檢查方法? 應用我院Philips iU-Elite超聲診斷儀進行乳腺檢查，應用L12-5型探頭，探頭頻率為5～12 MHz，VL13-5型探頭頻率為5～13 MHz，首先應用L12-5探頭進行常規二維超聲乳腺掃查，明確腫塊的部位、大小、形態以及內部回聲，后應用VL13-5型探頭對可疑乳腺腫塊進行三維掃查，檢查過程中要求患者屏氣15 s，獲取超聲聲像圖后傳輸至后處理站中，應用Qlab定量分析軟件對圖像進行分析，將腫塊均為多層面并在矢狀位圖像中描繪每層腫瘤的邊界，最終軟件自動生成腫瘤體積并存儲，每個腫塊進行3次采集、測量，取其并均值作為最終結果。TVDT計算公式為：TVDT=△T×log2/log（V2/V1），其中△T為兩次檢查間隔時間，V1、V2為連續第1次、第2次三維成像時腫塊體積。

1.2.2 標本采集與檢測? 兩組患者均接受外科手術治療，術中留取病灶局部組織標本切片;采用實時熒光定量PCR法測定標本組織中增殖基因PKM 2、Notch 1、FSCN 1、FBXW 7、HSG、EBP50，以及侵襲基因Gab 2、VEGF、NDRG 1、DKK-1、NUAK 1的表達。檢測方法如下：①樣品RNA的提取（溶解凍存細胞，兩相分離，RNA沉淀，移去上清液清洗RNA，RNA干燥，溶解RNA沉淀）;②RNA質量檢測（檢測濃度、純度，制膠，準備RNA樣品，電泳）;③合成cDNA;④針對每一個需要測量的基因，選擇相應表達該基因的cDNA模板進行PCR反應;⑤對各樣品的目的基因和管家基因分別進行實時熒光定量PCR反應。設備采用Bio-Rad伯樂PCR儀（型號：T100），檢測各目的基因所需要試劑均由R&D Systems提供，嚴格按照說明書操作。

1.2.3 PCR測定? 所有cDNA樣品分別配置實時定量分析PCR反應體系，配置方法如下：SYBR Green 1染料10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、dNTP 1 μL、Taq聚合酶2 μL、待測樣品cDNA 5 μL、ddH2O 30 μL，總體積50 μL，輕彈管底，混合溶液，6000 r/min短暫離心。將配置好的PCR反應溶液置于實時熒光定量PCR儀上，進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃預變性2 min，93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共計40個循環，最后72℃ 7 min延伸。增殖基因與侵襲基因的引物序列見表1。

1.3 觀察指標

比較乳腺癌與乳腺腺瘤患者病灶TVDT水平的差異，并觀察乳腺癌、乳腺腺瘤組織中惡性基因表達以及MVD情況;分析TVDT與乳腺癌惡性基因表達及MVD水平的相關性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗;乳腺癌組織TVDT水平與惡性基因的相關性采用Pearson檢驗分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌與乳腺腺瘤腫瘤病灶TVDT水平比較

乳腺癌腫瘤病灶TVDT水平均明顯低于乳腺腺瘤患者，且浸潤性導管癌患者腫瘤TVDT水平明顯低于導管內原位癌患者，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表1。1例患者首次檢查，其體積評估為1.34 mL;93 d后復查，體積評估為2.18 mL，TVDT為133 d，術后病理證實為三陰乳腺癌。見圖1～2。

2.2 乳腺癌與乳腺腺瘤腫瘤組織中惡性分子表達情況比較

乳腺癌患者促增殖基因中PKM 2、Notch 1、FSCN 1表達水平明顯高于乳腺腺瘤，而抗增殖基因FBXW 7、HSG、EBP50水平明顯低于乳腺腺瘤患者，差異有統計學意義（P < 0.05）。 乳腺癌患者促侵襲基因中Gab 2、VEGF表達水平明顯高于乳腺腺瘤，而抗增殖基因NDRG1、DKK-1、NUAK 1水平明顯低于乳腺腺瘤患者，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2～3。

2.3 TVDT與腫瘤增殖/侵襲因子表達的相關性分析

Pearson檢驗發現乳腺癌病灶TVDT水平與增殖、侵襲相關基因表達水平具有密切關系。其中TVDT與腫瘤增殖相關基因PKM 2、Notch 1、FSCN 1、Gab 2、VEGF mRNA表達量呈負相關，與FBXW 7、HSG、EBP50、NDRG1、DKK-1、NUAK 1 mRNA表達量呈增相關（P < 0.05）。見表4。

3 討論

隨著近年來腫瘤分子生物學研究的不斷深入，臨床已將乳腺癌作為一類在分子水平上具有高度異質性的疾病，具有相同臨床病理特征的乳腺癌患者往往在近遠期預后結局方面存在一定差異，其對同一治療方案有著不同的反應性，因此在基因分子層面評價乳腺癌病情對其治療與預后評估具有重要的臨床意義[4-5]。但基于腫瘤增殖/侵襲分子層面的檢查對醫療機構的要求較高，具有推廣難度大、技術水平要求高的缺點，因此通過其他輔助檢查手段替代基因分子檢查，并達到其實際評價效果，是近年來臨床研究熱點與難點[6]。

TVDT是近年來臨床開展的新型超聲檢查技術，其通過三維超聲技術獲取基礎數據，并且間斷性的檢測能夠客觀地評價腫瘤病灶的自然生長率以及生物惡性能力，目前已被應用于肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的輔助診斷與病情、預后評估[7-8]。而本研究結果顯示，乳腺癌患者TVDT水平明顯低于乳腺腺瘤，提示TVDT初步鑒別診斷乳腺良惡性結節，并且在腫瘤增殖/侵襲分子方面，乳腺癌病灶TVDT水平與增殖、侵襲相關基因表達水平具有密切關系[9]，TVDT與腫瘤增殖相關基因PKM 2、Notch 1、FSCN 1、Gab 2、VEGF mRNA表達量呈負相關，與FBXW 7、HSG、EBP50、NDRG 1、DKK-1、NUAK 1 mRNA表達量呈正相關，并且隨著惡性程度的增加，其TVDT明顯縮短，提示TVDT在一定程度上能夠直接反映乳腺癌病灶的增殖與侵襲能力，能夠為臨床轉歸與預后評估提供客觀、準確的證據[10]。

傳統的腫瘤體積測量評估方法為利用X線或磁共振成像（MRI），通過橢圓球體經驗公式計算，但腫瘤病灶往往呈不規則形狀，因此評價腫瘤的體積誤差相對較大，在兩次間隔檢查比較中并不具有臨床意義，而TVDT能夠在各個層面勾勒腫瘤邊界，并通過專業軟件自動獲取數據，較傳統橢圓球體經驗公式計算結果更具準確性與可靠性，兩次間隔檢查數據結果比較也更具評估價值[11]。而通過進一步回顧分析可知，腫瘤組織增殖/侵襲基因的表達是導致惡性腫瘤細胞異常增殖與遠處侵襲轉移的原動力，因此檢測腫瘤組織增殖/侵襲基因的表達量能客觀的評價腫瘤的惡性程度以及侵襲、轉移風險[12-13]。其中PKM 2主要在胚胎與腫瘤組織中表達，PKM 2的表達水平降低會影響凋亡相關蛋白的表達，并能夠促進腫瘤細胞的凋亡;Notch 1則在細胞增生分化、腫瘤血管生成等方面具有一定的促進作用;當RNA干擾Notch 1的表達后，能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖并降低腫瘤細胞的惡性程度[14-15];FBXW 7一般為明顯的抑癌基因，乳腺癌組織中FBXW 7的表達量明顯低于癌旁正常組織，通過特異性的增加FBXW 7的表達量能顯著抑制腫瘤細胞的惡性進展[16];HSG則為增殖抑制基因，其能夠有效抑制心血管疾病細胞的增殖與遷移，并且能夠抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞的凋亡;EBP50是調控細胞增殖周期中的重要分子之一，實胃癌、宮頸癌、結直腸癌等惡性腫瘤中EBP50的表達量明顯降低[17-18]。結合上述研究與本研究結果，分析認為TVDT水平能夠客觀反映乳腺癌腫瘤組織細胞的增殖與侵襲活性，可為臨床診斷、預后轉歸評估提供具有參考價值的證據[19-20]。

綜上所述，乳腺癌患者可出現TVDT異常降低現象，且其降低程度與乳腺癌患者增殖、侵襲相關基因的表達活性具有密切聯系，因此基于TVDT可實現乳腺癌患者治療效果及預后結局的初步評估。但本研究仍存在一定的不足之處，如納入的乳腺癌、乳腺腺瘤患者樣本量相對較小，可能影響結果結論的準確性，且本研究并未結合患者預后結局、近遠期生存率進行相關性分析，TVDT應用于乳腺癌中的臨床價值仍有待于進一步挖掘。

[參考文獻]

[1]? 程春霞，李廷富，祝青.常規超聲聯合超聲彈性成像對老年女性三陰性乳腺癌的診斷價值[J].中國實驗診斷學，2015，18（10）：1744-1746.

[2]? 彭愛云，蔣環裕，張文艷.探討超聲彈性成像聯合常規超聲在乳腺良惡性病變鑒別診斷中的價值[J].現代醫用影像學，2017，26（4）：1051-1052.

[3]? 曹秋月，黃敏.乳腺癌超聲診斷的現狀和進展[J].臨床超聲醫學雜志，2012，14（3）：183-186.

[4]? Au FW，Ghai S，Lu F，et al. Histoligical Grade and Immunohistochemical Biomarkers of Breast Cancer：Correlation to Ultrasound Features [J]. J Ultras Med，2017，36（9）：1883.

[5]? 郭少仁，李興霞，吳榮秀.乳腺癌超聲診斷綜合應用的新進展[J].河北醫藥，2012，34（4）：582-584.

[6]? Gagliato DDM，Gonzalez-Angulo AM，Lei X，et al. Clinical impact of delaying initiation of adjuvant chemotherapy in patients with breast cancer [J]. J Clin Oncol，2014，32（8）：735-744.

[7]? Alzahrani EO，Asiri A，El-Dessoky MM，et al. Quiescence as an explanation of Gompertzian tumor growth revisited [J]. Math Bio Sci，2014，309（254）：76-82.

[8]? Gandini S，Guerrierigonzaga A，Pruneri G，et al. Association of molecular subtypes with Ki-67 changes in untreated breast cancer patients undergoing presurgical trials [J]. Ann Oncol，2014，25（3）：618-623.

[9]? 楊美琴，劉桂林，方明，等.彈性成像對超聲診斷乳腺癌腋淋巴結性質準確性的提升作用[J].中華全科醫學，2016， 14（1）：111-113.

[10]? Ryu EB，Chang JM，Seo M，et al. Tumour volume doubling time of molecular breast cancer subtypes assessed by serial breast ultrasound [J]. Eur Radiol，2014，24（9）：2227-2235.

[11]? 黃晶，王彥，程魏，等.血清AFP倍增時間、腫瘤體積倍增時間與肝癌分化程度的相關性分析[J].河北醫藥，2016， 33（1）：112-114.

[12]? Gandini S，Guerrierigonzaga A，Pruneri G，et al. Association of molecular subtypes with Ki-67 changes in untreated breast cancer patients undergoing pre-surgical trials [J]. Ann Oncol，2014，25（3）：618-623.

[13]? 韓思維，丁炎，吳鵬西，等.乳腺癌超聲及超聲造影與預后分子病理學標志物相關性研究[J].生物醫學工程與臨床，2016，18（3）：261-265.

[14]? Gregory SA，Emblem KE，Pavlina P，et al. Increased survival of glioblastoma patients who respond to antiangiogenic therapy with elevated blood perfusion [J]. Cancer Res，2012，72（2）：402-407.

[15]? 徐樂，何琳，陳濤，等.乳腺癌超聲圖像特征與ER、PR、CerbB-2的相關性研究[J].第三軍醫大學學報，2016， 38（2）：182-186.

[16]? 吳磊，惠慧，董楠，等.沉默CD44表達對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖與侵襲的影響[J].現代腫瘤醫學，2015，23（14）：1967-1970.

[17]? Yip CH，Bhoo-Pathy N，Daniel J，et al. Roles of Ki67 in breast cancer-important for management [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2016，17（3）：1077-1082.

[18]? 丁炎，朱巧英，宣旻，等.影響乳腺癌體積倍增時間的相關因素[J].實用醫學雜志，2016，32（18）：2955-2958.

[19]? 王根進.超聲腫瘤體積倍增時間（TVDT）與乳腺癌病灶內惡性分子表達的相關性[J].海南醫學院學報，2018， 24（8）：885-888.

[20]? 陳俊，丁炎，朱巧英，等.乳腺癌體積倍增時間與ER、PR、HER-2及Ki-67的相關性研究[J].東南大學學報：醫學版，2016，35（6）：878-881.

（收稿日期：2018-11-20? 本文編輯：王? ?蕾）