五指毛桃中補骨脂素提取條件的研究

桂青　周立軍　鄭定華　潘劍　黃堅雄　袁淑娜　陳俊明　李娟

摘 要 補骨脂素是五指毛桃中的有效成分之一，是很有價值的質(zhì)量評價指標(biāo)。本文以超聲輔助溶劑提取法提取五指毛桃中的補骨脂素，采用HPLC法對提取液中補骨脂素的含量進(jìn)行測定，主要研究溶劑類型、料液比、提取溫度、提取時間及樣品顆粒度等因素對提取效果的影響，確定主要的影響因素及五指毛桃中補骨脂素的提取方法。結(jié)果表明：溶劑濃度、溫度、時間、顆粒度是影響補骨脂素提取的主要因素。五指毛桃中補骨脂素的提取可采用60%乙醇為溶劑，物料顆粒為70～100目，料液比為1∶10，60℃超聲30 min。

關(guān)鍵詞 五指毛桃 ；補骨脂素 ；提取 ；影響因素

中圖分類號 O652.62 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.06.016

Extraction Conditions for Psoralen from Ficus hirta Vahl.

GUI Qing ZHOU Lijun ZHENG Dinghua PAN Jian

HUANG Jianxiong YUAN Shuna CHEN Junming LI Juan

（Rubber Research Institute， CATAS； Research Center for Utilization of Under-forest Resources； Danzhou Investigation & Experiment Station of Tropical Crops， Ministry of Agriculture，

P. R. China， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract Psoralen is an active component and the most valuable quality assessment indicator in Ficus hirta Vahl.. The psoralen was extracted using organic solvent by ultrasonic-assisted solvent extraction method， and the content of psoralen was determined by HPLC. The possible factors affecting extraction， such as extraction solvent type， sample size， liquid-solid ratio， extraction temperature and time， were analyzed to identify the major factors affecting the extraction and develop an extraction method for psoralen. The results showed that extraction solvent concentration， extraction temperature， extraction time and sample size were the major factors that affected the extraction of psoralen. Psoralen could be extracted from F. hirta Vahl. with 60% ethyl alcohol as solvent， and ultrasonic-assisted for 30 min in a 60 C water bath at the liquid-solid ratio of 1∶10， the granular material size being 70-100 mesh.

Kewords Ficus hirta Vahl. ； psoralen ； extraction ； affecting factors

五指毛桃，別名南芪、五爪龍、五指牛奶，是桑科植物粗葉榕（Ficus hirta Vahl.）的根，是我國華南地區(qū)著名的藥食兩用植物[1]。林勵等[2]和魏剛等[3]通過實驗證明補骨脂素是五指毛桃的有效成分之一，且為最有價值的質(zhì)量評價指標(biāo)。

補骨脂素的提取方法主要有溶劑提取法[4]和超臨界CO2萃取法[5]。因超臨界萃取需要較高的壓力，因此，常用的提取方法仍為溶劑提取法。目前文獻(xiàn)報道的五指毛桃中補骨脂素的提取溶劑和方法各不相同，如甲醇冷浸提取法[6]，三氯甲烷水浴回流提取法[7]，乙醇超聲提取法[8]，甲醇超聲提取法[9]。補骨脂素的測定方法主要有3種，薄層色譜法（TLC）[6]、氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[2-3]和高效液相色譜法（HPLC）[7-9]。其中HPLC不僅能定性測定，而且定量測定比TLC和GC-MS更簡便快速、結(jié)果也更準(zhǔn)確，因此，HPLC是目前使用最普遍的測定補骨脂素的方法。

本文以橡膠林下種植的五指毛桃為實驗材料，以HPLC為補骨脂素含量測定方法，研究不同提取方式、提取溶劑、提取溫度等因素對補骨脂素提取效果的影響，確定補骨脂素的提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

五指毛桃于天然橡膠林下種植3 a，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所實驗基地。

1.1.2 試劑

無水乙醇：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；補骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.00%），多倫多化學(xué)藥品研究所，加拿大；Thermo Fisher乙腈（色譜純），德國；超純水；其他試劑未作特別說明均為分析純。

1.1.3 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國；P30H超聲波清洗器，德國。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

五指毛桃洗凈后，經(jīng)切片、干燥、粉碎后過分樣篩。稱取樣品3.0000 g于三角瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，于超聲波清洗器中提取后過濾并定容至50 mL。取2 mL提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用于高效液相色譜分析。

1.2.2 影響因素

主要研究溶劑類型、樣品顆粒度、料液比、提取溫度、提取時間對五指毛桃中補骨脂素提取效果的影響。

1.2.3 高效液相色譜條件

參考王曉平[9]的方法，液相色譜條件略作修改，色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國；流動相為水∶乙腈（V：V）=55∶45；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：245 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.4 補骨脂素含量的測定

配制濃度為10～500 μg/mL的補骨脂素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3的條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品提取液按照1.2.3的條件進(jìn)樣后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中補骨脂素含量。最后根據(jù)稱取樣品的重量，換算成樣品中補骨脂素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對五指毛桃補骨脂素提取效果

晏蕓等[10]的研究結(jié)果表明，一定濃度的乙醇溶液更有利于補骨脂素的提取。本實驗選擇常用的甲醇、乙醇、三氯甲烷以及50%甲醇、50%乙醇為提取溶劑。從圖1中看出，在70℃水浴回流提取的條件下，補骨脂素的提取效果為50%乙醇、甲醇、50%甲醇優(yōu)于乙醇和三氯甲烷。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，乙醇、三氯甲烷與其他試劑的提取效果有顯著性差異（p<0.05），甲醇、50%甲醇以及50%乙醇的提取效果沒有顯著性差異（p>0.05）。這說明，采用甲醇、50%乙醇和50%甲醇都能很好的將五指毛桃中的補骨脂素提取出來，但從安全和經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇50%乙醇為提取溶劑較好。

2.2 不同提取方式對五指毛桃補骨脂素提取效果

根據(jù)研究報道，五指毛桃中補骨脂素的提取方式有冷浸、加熱回流、超聲提取等方式。本文采用50%乙醇為提取溶劑，比較了冷浸3 h、冷浸1周、70℃水浴回流3 h、70℃超聲提取30 min對五指毛桃中補骨脂素提取效果的影響。圖2的結(jié)果表明，冷浸3 h與冷浸1周對補骨脂素的提取效果影響不顯著（p>0.05），顯著低于70℃水浴和超聲方法的提取效果（p<0.05）。70℃水浴回流3 h與70℃超聲提取30 min的提取效果相當(dāng)（p>0.05），考慮到水浴回流提取所用的時間較長，效率低，不利于節(jié)約時間和能源。因此，選擇超聲提取方法較好。

2.3 超聲條件對五指毛桃補骨脂素提取效果

2.3.1 乙醇濃度的影響

實驗以濃度為40%～80%的乙醇為提取溶劑，比較在常溫條件下超聲提取，對補骨脂素的提取效果的影響。結(jié)果表明，濃度在40%～60%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，補骨脂素能被更多的提取出來；而隨著濃度繼續(xù)增加，補骨脂素的提取效率卻有所降低（圖3）。實驗結(jié)果與晏蕓等[10]報道的隨著乙醇濃度的增加，提取率先增加后降低是一致的。

2.3.2 料液比的影響

以60%乙醇為提取溶劑，考察料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25時對補骨脂素提取效果的影響。結(jié)果表明，不同料液比時提取效果略有差異，通過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不同料液比處理間沒有顯著性差異。因此，為節(jié)約試劑考慮，選擇料液比為1∶10（圖4）。

2.3.3 超聲起始溫度的影響

實驗選擇的超聲起始溫度分別為30、40、60、80℃，研究了起始溫度對五指毛桃補骨脂素提取效果的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，補骨脂素的提取效率先升高后降低，60℃時提取效率最高，如圖5所示。這可能是因為溫度升高，促進(jìn)了傳質(zhì)和傳熱，從而提高了提取率，而溫度過高，則會加速補骨脂素開環(huán)，使提取率降低[10]。

2.3.4 超聲時間的影響

在以60%乙醇溶液為提取溶劑，料液比為1：10，超聲起始溫度為60℃的條件下，研究超聲時間為10、20、30、40 min時補骨脂素的提取效果。實驗結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，補骨脂素的提取率升高，30 min時提取效率最高，時間繼續(xù)延長對提取率的影響不大（圖6）。

2.3.5 顆粒度的影響

不同顆粒度樣品均以60%乙醇為溶劑，料液比為1∶10，在60℃條件下超聲提取30 min，得到的補骨脂素含量結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，隨著顆粒減小，補骨脂素含量先增加后降低，顆粒度分別為70和100目時，補骨脂素含量最高，且沒有顯著性差異（p>0.05）。因此，認(rèn)為70～100目時，提取效果較好。但顆粒度為200目時卻不利于補骨脂素提取。可能的原因是顆粒越小，增加了物料與溶劑的接觸面積，但過度粉碎，卻易使物料黏在一起，從而影響有效成分的提取[11]。

2.4 五指毛桃中補骨脂素含量的測定

隨機(jī)選取了10株五指毛桃，取其根，清洗、切片、干燥粉碎后過100目篩，采用60%乙醇為溶劑，料液比為1∶10，60℃超聲提取30 min，過濾得濾液，定容至50 mL，按照1.2.4的方法測定提取液中補骨脂素，換算成樣品中補骨脂素含量結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，相同樣品間重復(fù)性較好，株間差異較大，單株補骨脂素含量最高達(dá)1.117 5 mg/g，最低僅0.155 0 mg/g，這可能與每株的生長狀況不同有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

溶劑、溫度、物料顆粒、提取時間均是影響樣品中活性成分提取的主要因素。溶劑提取是根據(jù)“相似相溶”的原理，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)結(jié)構(gòu)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇８鶕?jù)補骨脂素的化學(xué)性質(zhì)，乙醇和氯仿均是較好的提取溶劑，但是實驗結(jié)果表明，乙醇和氯仿的提取效果不如甲醇以及50%乙醇，這可能是因為五指毛桃樣品中其他化學(xué)物質(zhì)的存在，影響了補骨脂素在溶劑中的溶出率。溶劑濃度實驗說明，適量提高乙醇中水的比例有利于補骨脂素的溶出。溫度是影響傳熱和傳質(zhì)效率的重要因素，60℃較適合補骨脂素的提取。超聲時間越長越有利于補骨脂素的提取，但是30 min時補骨脂素幾乎全部被提取出來，再延長提取時間，補骨脂素的含量也不會再增加。顆粒度實驗說明樣品顆粒為70～100目時更有利于補骨脂素的提取。

目前，對五指毛桃研究重點在測定方法的建立以及活性成分的分離與評價，而其中補骨脂素的提取方法各有不同。通過本實驗，建立了五指毛桃中補骨脂素的提取方法：樣品干燥后粉碎至顆粒70～100目，采用60%乙醇為溶劑，料液比為1∶10，60℃超聲30 min。

實驗最后隨機(jī)選擇了10株五指毛桃，采用本方法對不同單株樣品中補骨脂素的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，相同樣品的提取效果穩(wěn)定，提取方法是可行的，但株間差異較大。是何原因造成補骨脂素在相同品種不同單株五指毛桃中含量差異較大，有待繼續(xù)研究。

本方法與冷浸法和加熱回流提取法相比，具有溶劑的危害性小、提取效率更高、重復(fù)性好等特點，是五指毛桃中補骨脂素提取的理想方法。

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