UDCA聯合維生素D治療原發性膽汁性肝硬化患者外周血T細胞亞群變化及其對療效的影響

陳小君，宋洋

受對疾病的認識及抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibody，AMA）檢測普及的影響，原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）在我國的檢出率逐漸增加[1，2]，該病屬于自身免疫性疾病，

主要表現為慢性進展性肝內中小膽管非化膿性炎癥，持續發展可演變為肝硬化或肝衰竭[3]。目前，臨床主要應用熊去氧膽酸（UDCA）治療。臨床研究顯示該藥能夠有效改善患者臨床癥狀及肝功能，進而延緩疾病進展，改善預后[4，5]。但報道亦指出，約40%患者對該藥治療不應答[6]。近年，有報道顯示維生素D對部分自身免疫性疾病治療有效，且發現其有抑制肝纖維化發生發展的作用[7]。本研究嘗試應用UDCA和維生素D治療PBC患者，以觀察治療應答情況，并觀察了外周血T細胞亞群的變化，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2014年1月～2015年12月我院收治的PBC患者92例，男28例，女64例；年齡44～65歲，平均年齡（52.7±12.1）歲。診斷參考2009年美國肝病學會（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）制定的標準診斷，符合反映慢性膽汁淤積的血生化指標改變，主要是外周血堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）升高，AMA陽性。肝功能Child-Pugh A級72例，B級20例；Ludwig組織學分級Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期38例。排除合并自身免疫性肝炎、原發性硬化性膽管炎及其它急慢性肝臟疾病患者，排除合并嚴重的心肺疾病、妊娠及哺乳期婦女。采用隨機數字表法將患者分為兩組，兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。所有患者均對本研究知情且簽署同意書，本研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 治療方法 對照組應用UDCA膠囊（四川科瑞德制藥有限公司，國藥準字H20123205）13～15 mg.kg-1·d-1或250 mg口服，3次/d；觀察組在此基礎上給予維生素D2軟膠囊（大連水產藥業有限公司，國藥準字H20073445）1200 IU口服，1次/d。所有患者在接受治療后的第4 w、12 w、24 w來院復查，明確無明顯不良反應后，長期維持治療。

1.3 檢測 使用美國Roche E-602全自動免疫分析儀及其配套試劑檢測外周血25-羥基維生素D[25-hydroxy vitamin D，25（OH）D]；常規檢測血生化指標；使用流式細胞術（FACS Calibur流式細胞儀，美國BD）檢測外周血CD4+Treg和Th17細胞水平。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件處理數據，計量資料以（±s）表示，采用配對或獨立樣本的t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，采用雙變量Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組治療前后外周血25（OH）D水平和外周血T細胞亞群變化的比較 治療前兩組外周血25（OH）D水平、CD4+Treg、Th17細胞計數和 T17/CD4+Treg比值差異無統計學意義（P＞0.05）；在持續治療1年后，觀察組外周血25（OH）D水平和CD4+Treg細胞計數明顯高于對照組，Th17細胞計數和Th17/CD4+Treg比值明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，表1、圖1）。

2.2 兩組治療前后肝功能指標變化 治療前，兩組肝功能指標差異無統計學意義（P＞0.05）；在持續治療1年后，觀察組血清ALT、AST、ALP、GGT水平均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）。

2.3 血清25（OH）D與外周血Th17、CD4+Treg細胞、Th17/CD4+Treg比值相關性分析 對兩組患者治療前后各指標行Pearson相關性分析，結果顯示血清25（OH）D水平與CD4+Treg細胞百分比呈明顯正相關（r=0.961，P=0.000，圖2），而血清 25（OH）D 水平與Th17細胞或Th17/CD4+Treg比值無明顯相關性（P＞0.05）。

2.4 外周血CD4+Treg細胞與肝功能指標相關性分析 經Pearson相關性分析，結果顯示外周血CD4+Treg細胞百分比與血清GGT或ALP水平呈顯著正相關（r=0.822，r=0.687，P 均 =0.000）。

表1 兩組血清維生素D和外周血T細胞亞群（±s）比較

表1 兩組血清維生素D和外周血T細胞亞群（±s）比較

與治療前比，①P＜0.05；與對照組比，②P＜0.05

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圖1 外周血T細胞亞群變化

A：根據前向角FSC和側向角SSC參數設置淋巴細胞為R1門；B：根據FITC參數在R1門中設置CD4+淋巴細胞為R2門；C：根據PE-IL-17熒光在R2門中設定Th17細胞；D：根據APC-CD25、PE-FoxP3在R2中設定CD4+Treg細胞，其中C、D為同一患者治療前Th17細胞和CD4+Treg細胞檢測結果

圖2 血清25（OH）D水平與外周血CD4+Treg細胞相關性擬合曲線 【血清CD4+Treg=0.188×血清25（OH）D-0.178，r=0.961，P=0.000】

表2 兩組肝功能指標（±s）比較

表2 兩組肝功能指標（±s）比較

與治療前比，①P＜0.05；與對照組比，②P＜0.05

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3 討論

既往多項研究探討了維生素D與肝纖維化、肝硬化及部分自身免疫性肝病的相關性。朱隴東等[8]綜述了維生素D缺乏程度對肝纖維化和肝硬化的影響，發現其與疾病程度、肝組織學病理學損傷、并發癥和預后存在密切關系。鄧文升等[9]在動物實驗中發現1，25（OH）2D3能明顯減輕四氯化碳所致的大鼠肝組織損傷，抑制肝纖維化發展，認為其作用機制可能與抑制TGF-β1及抑制HSC激活有關。于露露等[10]報道則顯示25（OH）D濃度的升高與肝硬化發病風險的下降存在線性關系。基于上述結論，部分研究[11，12]進一步指出維生素D與PBC的發生及發展有關，且建議在常規應用UDCA治療的基礎上，積極補充維生素D，但尚缺乏直接的臨床驗證。本研究觀察組在應用聯合治療1年后，肝功能指標明顯改善，且改善效果明顯好于對照組，提示補充外源性維生素D能夠有效改善PBC患者病情。

維生素D具有一定的免疫調節作用。李敏等[13]全面地分析了維生素D與免疫系統的關系，顯示維生素D可能對單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞等免疫細胞的活性有一定的影響。李海園[14]在兒童疾病發現維生素D的重要作用。國內其他研究[15-17]也報道了類似的發現。本研究也觀察到血清25（OH）D與CD4+Treg細胞水平呈直線正相關。PBC屬于自身免疫性疾病，其致損傷機制與免疫系統功能紊亂有關。結合本研究發現，我們認為PBC患者存在免疫功能失衡，25（OH）D可能直接影響了CD4+Treg細胞數，加用維生素D治療可能提高了PBC患者的免疫細胞數量。

PBC患者外周血及肝臟Treg細胞比例均降低。部分研究[15，16]認為這與患者肝功能損傷有關，即Treg細胞減少，影響免疫耐受，導致針對膽管上皮細胞線粒體內膜上自身抗原的AMA大量生成與釋放，其與線粒體抗原結合后可破壞靶細胞的新陳代謝，誘導功能紊亂，最終形成組織損傷。Treg細胞比例降低還會促使膽管上皮細胞表達IL-17受體，與IL-17結合后，可促進多種炎癥因子，如IL-6、IL-1β等的釋放，加劇局部炎癥反應。本研究觀察到CD4+Treg細胞與GGT、ALP水平呈顯著正相關，可能正與上述因素有關。另一方面，免疫功能紊亂引起肝內膽管炎，則會影響肝臟對膽紅素和ALP等經膽道排泄，又會反饋影響維生素D的吸收，形成負性循環[17]。可見，通過補充維生素D，增加CD4+Treg細胞比率，有助于延緩PBC的進程，改善患者病情。

本研究觀察到兩組治療后血清25（OH）D水平上升，提示補充外源性維生素D能夠有效提升患者機體25（OH）D水平。觀察組患者CD4+Treg細胞計數也明顯提升，Th17細胞計數下降，則提示Treg細胞失衡能獲得有效的糾正。但相關性分析僅顯示25（OH）D與CD4+Treg細胞有線性相關性，則提示維生素D的作用可能僅限于對CD4+Treg細胞的激活，為后續開展更具針對性的研究有一定的指導價值。

綜上所述，補充外源性維生素D能夠有效改善PBC患者病情，而這種治療作用可能與其能夠有效提升CD4+Treg細胞水平有關。

[1]何麗芬，賴伊杰，賴力英，等.原發性膽汁性肝硬化的臨床特點.中南大學學報（醫學版），2015，40（12）:1333-1339.

[2]姚定康.原發性膽汁性肝硬化的診斷.實用肝臟病雜志，2013，16（2）:99-101.

[3]張婷，馬丹旭，李晞，等.原發性膽汁性肝硬化不同分期中Th17細胞及轉化生長因子-β1的水平差異.中華風濕病學雜志，2015，19（8）:507-511.

[4]郭銳，覃進.隨機對照試驗研究UDCA治療原發性膽汁性肝硬化患者的療效及安全性.實用肝臟病雜志，2017，20（1）:109-110.

[5]吳穎，姚定康，朱樑，等.UDCA聯合扶正化瘀膠囊治療原發性膽汁性肝硬化臨床觀察.中國中西醫結合雜志，2012，32（11）:1477-1482.

[6]韓炎炎，戴曉波.云芝肝泰膠囊輔助UDCA片治療原發性膽汁性肝硬化及對患者免疫學指標的影響.中國老年學雜志，2015，35（23）:6812-6814.

[7]蘇榮，席向紅，唐秀英，等.25羥維生素D在原發性膽汁性肝硬化中的診斷價值.中國免疫學雜志，2016，32（12）:1830-1832，1836.

[8]朱隴東，段鐘平.維生素D與肝纖維化的關系研究.胃腸病學和肝病學雜志，2013，22（10）:951-954.

[9]鄧文升，顧磊，周鴻，等.1，25（OH）2D3抑制肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA表達的研究.肝膽胰外科雜志，2015，27（3）:214-218.

[10]于露露，尹梁宇，陳汶，等.維生素D與肝硬化發病風險關系的前瞻性研究. 中華肝臟病雜志，2013，21（3）:202-206.

[11]鐘燕明，武希潤，王琦，等.原發性膽汁性肝硬化患者外周血25-羥維生素D3、Th17細胞、CD4+調節性T細胞的變化及其意義.中華肝臟病雜志，2016，24（11）:829-833.

[12]楊曉丹，李莉華，范艷玲，等.維生素D受體位點基因多態性與自身免疫性肝病易感性的關系.中國醫師進修雜志，2014，37（22）:41-45.

[13]李敏，彭雁忠，熊曉佳，等.維生素D與免疫.國際免疫學雜志，2014，37（5）:403-407.

[14]李海園.維生素D的免疫調節作用與兒童疾病.臨床兒科雜志，2012，30（8）:792-794.

[15]李金潺，衛丹丹，李小峰，等.維生素D在自身免疫性疾病中的作用. 中國全科醫學，2015，18（18）:2184-2187.

[16]何麗杰，王靜，笪宇蓉，等.維生素D對慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒療效的影響.中國免疫學雜志，2016，32（5）:729-733.

[17]尹成敏，時慶康.早期補充維生素D對早產兒免疫球蛋白和IL-2的影響. 中國生化藥物雜志，2014，34（9）:157-159.

[18]高會霞，劉玉珍，袁文芳，等.原發性膽汁性肝硬化患者調節性T細胞及相關細胞因子與肝功能損傷的相關性研究.現代中西醫結合雜志，2012，21（4）:345-347.

[19]鐘燕明，武希潤，王琦，等.原發性膽汁性肝硬化患者外周血25-羥維生素D3、Th17細胞、CD4+調節性T細胞的變化及其意義.中華肝臟病雜志，2016，24（11）:829-833.

[20]許茵，楊小娟，蒯守剛，等.原發性膽汁性肝硬化患者外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋調節性T細胞檢測及其臨床意義.中國實驗診斷學，2014，18（4）:592-594.