CIAPIN1對HepG2細胞增殖和細胞周期的影響

歐志濤，詹遠京，郭家偉，羅 鐸

細胞因子誘導的凋亡抑制分子1（cytokine-ind uced apoptosis inhibitor 1，CIAPIN1）是受體依賴性激酶Ras信號通路中的效應分子[1]。研究顯示，CIAPIN1被敲除后，胚胎鼠發育個體小，循環和造血器官，如心臟、肝臟、脾臟等發育異常[2]。另有研究指出，CIAPIN1表達與肝癌組織學分級呈負相關，與TNM分級呈正相關[3]。上述發現均提示CIAPIN1在肝癌的發生及發展過程中可能起重要作用，但CIAPIN1對肝癌細胞增殖能力的影響研究尚不多見。本研究構建重組慢病毒CIAPIN1表達載體和CIAPIN1沉默載體，探討了體外調控CIAPIN1基因表達對肝癌HepG2細胞增殖能力的影響，并初步分析了其作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和細胞 重組慢病毒CIAPIN1表達載體、CIAPIN1 siRNA慢病毒載體、無關對照siRNA慢病毒載體，均委托上海博上生物技術有限公司合成；ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix、LipofectamineTM 2000、293FT細胞，均購自Invitrogen公司；DMED培養液、胎牛血清，均購自Gibco公司；Matrigel，購自BD公司；全長 CIAPIN1 cDNA克隆pOTB7-CIAPIN1，購自上海英為信生物科技有限公司；鼠抗人CIAPIN1單克隆抗體、山羊抗鼠IgG-HRP，均購自Santa Cruz公司；EDTA購自Sigma公司；抗CyclinD1、抗CDK4、抗CDK2、抗Cyclin E抗體，購自Santa Cruz公司；NF-кB染色試劑購自Thermo公司；IKKβ、磷酸化IKBα、p65和磷酸化抗p65和抗PARP抗體，購自Bioworld Technology；RT-PCR檢測儀及其配套分析軟件，購自ABI公司；680型全自動酶標儀購自Bio-Rad公司；臺式離心機、37℃恒溫搖床，均為國產儀器。肝癌細胞株HepG2細胞由我院感染病研究所提供。

1.2 感染用病毒的包裝 取對數生長期293FT細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞密度至6×108個/L，接種至10 cm培養皿，在37℃、5%CO2環境下培養24 h，至細胞達70%～80%融合后，加入ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix、Lipofectamine TM 2000及預先制備的重組慢病毒載體DNA，進行轉染。48 h后，取病毒上清液，4℃下4000 g離心10 min，用0.45μm濾膜過濾，測定病毒滴度，分裝，置于-80℃保存。

1.3 病毒感染 取HepG2細胞，按105個/孔接種至6孔板，室溫培育8 h，分別加入CIAPIN1表達慢病毒、CIAPIN1 siRNA慢病毒、無關對照siRNA慢病毒感染或不轉染，病毒感染復數與細胞數比例為10：1。隨后，加入polybrene，調整其濃度至5 μg/ml，持續培養8 h，更換新鮮培養液，加入Blasticidin，調整其濃度至5 μg/ml，篩選培養2～3 w，獲得穩定的轉導細胞。為確保最終能夠獲得CIAPIN1基因高表達組、CIAPIN1基因低表達組，并與無關siRNA干擾組和空白對照組區分，采用RT-PCR法檢測各組CIAPIN1 RNA水平，選擇GAPDH基因為內參照。CIAPIN1引物序列：Forward 5’-CCA GTG GAG GCT CTG AAA GG-3’，Revers e 5’-GAC ACG CGG CCC TCA TT-3’，探針序列 ：5’-FAM-ATAAGCTTCAAGCGTTAA C-TAMRA-3’；GAPDH 引物序列：Forward 5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3’，Reverse 5’-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAA ATG-3’，探針序列：5’-FAM-CGA CAC CCA CTC CTC CAC CTT TGA CGC-TAMRA-3’。根據 Ct值確定對應基因的拷貝數，結果以CIAPIN1基因與內參照基因拷貝數比值表示。上述實驗中每組設6孔，取均值。

1.4 細胞CIAPIN1蛋白表達量檢測 采用免疫印跡法檢測，收集各組細胞，超聲破碎后測定蛋白含量，并取一定樣品，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至PVDF膜，以5%脫脂奶粉在4℃條件下封閉6 h。隨后，加入鼠抗人CIAPIN1抗體，在4℃條件下孵育過夜。再加山羊抗鼠IgG-HRP二抗，孵育1 h，以化學發光法檢測CIAPIN1蛋白表達量。

1.5 細胞增殖檢測 取對數生長期細胞，制備成4×104個/ml單細胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μl，每組24孔，進一步將各組分為4個小組，37℃、5%CO2條件下培養，4個小組分別培養24 h、48 h、72 h、96 h，加 5 mg/ml MTT 20μg，繼續培養 4 h，棄上清，加 DMSO 150 μl，震蕩溶解，在酶標儀上測量490 nm波長下光密度值，以此結果繪制4組細胞生長曲線。

1.6 細胞周期測定 將同步化的各組細胞以PBS洗2次，加入預冷75%乙醇，4℃過夜固定后，棄乙醇，再次以PBS洗，加RNase 100 μg/ml，加碘化丙啶避光染色20 min，上流式細胞儀（FACS Calibur分析型，美國Bio-Rad公司）測定細胞周期。

1.7 其它相關蛋白檢測 細胞周期相關蛋白分子包括 cyclinD1、CDK4、CDK2、cyclin E，NF-кB 信號通路相關分子、IKKβ、磷酸化IKBα、p65和磷酸化p65。均提取總蛋白后采用Western blotting法檢測。1.8統計學方法 應用SPSS 19.0軟件處理數據。CIAPIN1 mRNA及其蛋白的相對水平以（±s）表示，多組間數據的比較采用單因素方差分析及LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組細胞CIAPIN1 mRNA及其蛋白表達水平比較 CIAPIN高表達組CIAPIN1 mRNA及其蛋白表達水平較空白對照組或無關siRNA干擾組明顯升高（P＜0.05）；CIAPIN低表達組CIAPIN1 mRNA及其蛋白表達水平較空白對照組或無關siRNA干擾組明顯降低（P＜0.05）；空白對照組與無關siRNA干擾組IAPIN1 mRNA及其蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05，表1、圖1）。

表1 四組細胞CIAPIN1 mRNA及蛋白表達水平（±s）比較

表1 四組細胞CIAPIN1 mRNA及蛋白表達水平（±s）比較

與CIAPIN1高表達組比，①P＜0.05；與CIAPIN1低表達組比，②P＜0.05

孔數CIAPIN1高表達CIAPIN1低表達無關siRNA干擾空白對照6 6 6 6 CIAPIN1 mRNA CIAPIN1蛋白0.811±0.038 0.728±0.028 0.093±0.031① 0.183±0.035①0.287±0.045①② 0.410±0.053①②0.292±0.035①② 0.408±0.051①②F 35.855 37.036 P 0.000 0.000

A：CIAPIN1 高表達組；B：CIAPIN1 低表達組；C：無關siRNA干擾組；D：空白對照組；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖2 四組細胞增殖情況比較 CIAPIN1高表達組細胞生長旺盛，CIAPIN1低表達組細胞生長受到明顯抑制

2.2 四組細胞增殖情況比較 CIAPIN高表達組、無關siRNA干擾組和空白對照組細胞均持續保持良好的生長趨勢，而CIAPIN低表達組細胞生長受到明顯抑制（圖2）。

2.3 細胞周期變化情況 CIAPIN1高表達組S期和G2/M期細胞比例明顯高于其他各組，G0/G1期細胞比例明顯低于其它各組；CIAPIN1低表達組S期和G2/M期細胞比例明顯低于其它各組，G0/G1期細胞比例明顯高于其它各組（P＜0.05）；空白對照組與無關siRNA干擾組比，細胞周期差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 細胞周期（n=6，±s）比較

表2 細胞周期（n=6，±s）比較

與CIAPIN1高表達組比，①P＜0.05；與CIAPIN1低表達組比，②P＜0.05

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2.4 四組細胞周期蛋白水平比較 CIAPIN1高表達組 cyclinD1、CDK4、CDK2、cyclinE 表達明顯強于其它各組；CIAPIN1低表達組上述蛋白的表達明顯低于其它各組，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 四組細胞周期蛋白水平比較

2.5四組NF-кB信號通路相關分子的表達情況 CIAPIN1高表達組磷酸化IKBα和磷酸化p65表達高于其它各組，CIAPIN1低表達組上述指標低于其它各組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；CIAPIN1低表達組p65水平明顯高于其它各組，差異有統計學意義（P＜0.05，表3）。

表3 四組NF-кB信號通路相關分子（n=6，±s）表達情況

表3 四組NF-кB信號通路相關分子（n=6，±s）表達情況

與CIAPIN1高表達組比，①P＜0.05；與CIAPIN1低表達組比，②P＜0.05

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3 討論

CIAPIN1蛋白在胚胎和成人組織中廣泛存在[4-8]。在胎兒的早期血管細胞、干細胞、骨骼肌細胞等影響生長發育的細胞中表達極高，提示其對促進細胞生長發育有重要作用[9]；在成人，除上述組織外，胰島細胞、皮膚角質層細胞、睪丸間質細胞中也能檢出其高表達，提示其對維持細胞增殖有重要作用。

目前已有研究探討了CIAPIN1基因及其蛋白對多種腫瘤細胞的影響，但得出的結論并不完全一致。如楊靜等認為CIAPIN1基因在結腸癌組織低表達，可能與結腸癌的發生及發展有關，并指出抑制該基因的表達可能是靶向性治療結腸癌的新方向。研究發現下調CIAPIN1 mRNA有助于抑制慢性髓系白血病細胞系K562細胞的增殖能力，說明CIAPIN1 mRNA高水平可能與K562細胞的增殖有關。肝癌組織CIAPIN1 mRNA水平越高，腫瘤分化程度越低，TNM分期越高，提示其高表達與腫瘤惡化有關[3]。

本研究重點探討了CIAPIN1對HepG2增殖的影響，結果顯示其能促進腫瘤細胞增殖，細胞在G1/S期明顯縮短，而下調其表達，腫瘤細胞增殖能力明顯受抑制，細胞被阻滯在G1/S期，說明其對肝癌細胞的生物學影響是促進其增殖能力。

本研究觀察到CIAPIN1過表達組細胞周期相關蛋白 cyclinD1、CDK4、CDK2、cyclinE 均明顯上升，且磷酸化IKBα、磷酸化p65表達也明顯上升，提示CIAPIN1蛋白主要通過上調細胞周期蛋白、激活NF-кB通路等途徑影響肝癌細胞的增殖。已有多項研究證實NF-кB信號通路直接參與了肝癌的發生發展，干擾NF-кB信號通路活化能夠通過促細胞凋亡和改變細胞周期機制，抑制肝癌細胞的增殖。另有研究認為CIAPIN1基因還與腫瘤的血管形成和腫瘤多藥耐藥性形成等有明顯的相關性。

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