蔡冠軍 譚最 章長杰

【摘要】 目的：通過觀測攜帶人血管內皮生長因子-165（vascular endothelial growth factor，VEGF165）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang1）基因的重組腺相關病毒-2（adeno-associated virus，AAV-2）對兔肌組織的生物學效應，探討其促進血管再生的能力。方法：選取雄性新西蘭大白兔32只，隨機分為四組，每組各8只。用攜帶人VEGF165基因的病毒載體AAV-2-hVEGF165、攜帶人Ang1基因的病毒載體AAV-2-hAng1、攜帶-半乳糖苷酶（-gal）基因的rAAV-2-LacZ同時攜帶人Ang1/VEGF165基因的病毒載體AAV-2-hAng1/VEGF165直接注射新西蘭雄性大白兔肌組織中，4周后利用肉眼觀察和免疫組織化學染色法檢測它們的血管再生效應。結果：注射AAV-2-hAng1/VEGF165的肌組織內再生的血管豐富密集且管徑粗大，明顯優于AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1、AAV-2-LacZ的血管再生效應。結論：同時攜帶人Ang1、VEGF16兩種基因的AAV-2在肌組織中發揮最強的血管再生效應，單獨攜帶人Ang1、VEGF16兩種基因的AAV-2在肌組織也具有促進血管再生效應。AAV-2-hAng1/VEGF165不但可促進缺血肢體的血管生成、動脈生成、血流量的恢復，并且可降低血管的通透性，其療效優于

AAV-2-hVEGF165、AAV-2- hAng1、AAV-2-LacZ的單獨應用。

【關鍵詞】 血管生成素1； 血管內皮生長因子； 腺相關病毒； 血管新生

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.28.004

隨著社會人口老齡化的發展，缺血性血管疾病日益增多，已經成為威脅人類的主要疾病之一，其治療最終要靠血管的再生。VEGF165是一種強烈的有絲分裂素，也是一種分泌性分子，以可溶性調節物的形式調節內皮細胞的生長和血管形成，引起血管內皮細胞增殖，促進新生血管生成[1-5]。Ang1是新近發現的與血管生長密切相關的生物因子[6]，對血管內皮細胞有特異性作用，可誘導血管芽生，對內皮細胞有很重要的化學趨化反應及血管網狀形成作用[7]，通過多種途徑來維持血管的穩定性和完整性，是特異的血管生成正調節因子。本研究將同時攜帶人VEGF165、Ang1基因的重組腺相關病毒直接注射到新西蘭雄性大白兔下肢肌組織中，對比單獨應用，探討其是否可提高促血管再生能力。

1 材料與方法

1.1 材料 質粒phVEGF165、質粒phAng1、質粒phAV、質粒ph-LacZ、（有前期構建）AAV-Helper-Free System、感受態細胞Top10F、HEK293細胞株、高純度質粒小提中量試劑盒、磷酸鈣法細胞轉染試劑盒、平滑肌肌動蛋白（-SMA）一抗（DAKO）。

1.2 方法

1.2.1 rAAV載體的制備 pAAV-Ang1，pAAV-Helper，pAAV-RC，各2 g用磷酸鈣沉淀法共轉染HEK293細胞后繼續培養24 h，用氯仿處理-PEG/NaCL沉淀-氯仿抽提法，此即得到初步濃縮純化病毒AAV-2-hAng1[8]。同此方法制備AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1/VEGF165、AAV-2-LacZ。

1.2.2 AAV-2病毒的高濃縮純化 將制備的病毒AAV-2-hAng1、AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1/VEGF165、AAV-2-LacZ用centriplus YM-100的超濾管進行濃縮純化。

1.2.3 實驗分組 選取月齡為5～7個月，雄性新西蘭大白兔32只，體重2.0～2.5 kg，將它們分成四組，分組如下：（1）攜帶人VEGF165基因的病毒載體處理組（AAV-2-hVEGF165組）；（2）攜帶人Ang1基因的病毒載體處理組（AAV-2-hAng1組）；（3）攜帶-半乳糖苷酶（-gal）基因的處理組（rAAV-2-LacZ組）；（4）攜帶人Ang1/VEGF165基因的病毒載體處理組（AAV-2-hAng1/VEGF165），每組8只。對AAV-2-hAng1組，在每只實驗動物右上肢注射AAV-2-hAng1，2 mL。對AAV-2-hAng1/VEGF165組，每只實驗動物右下肢注射AAV-2-hAng1/VEGF165，2 mL。rAAV-2-LacZ組對每只實驗動物左上肢注射AAV-2-LacZ，2 mL。對AAV-2-hVEGF165組每只實驗動物左下肢注射AAV-2-hVEGF165，2 mL。注射部位用無損傷絲線縫扎肌膜做標記。

1.2.4 肉眼觀察 注射AAV-2病毒4周后，將各組實驗動物用氯氨酮按2 mg/kg進行肌肉注射麻醉后，取結扎絲線處切開皮膚及皮下組織，對比觀察攜帶不同基因的4種AAV-2病毒對缺血肢體血管再生效應。

1.2.5 組織學檢測 將麻醉的實驗動物，取絲線結扎標記的肌組織，冰凍切片，厚度7 m，利用針對-SMA的一抗進行免疫組化染色，隨機選取30個視野計數-SMA陽性的血管密度（-SMA陽性血管數/mm2）。

1.3 統計學處理 使用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料采用（x±s）表示，組內比較采用t檢驗，組間參數的比較采用單向方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肉眼觀察4種AAV-2病毒分別對缺血肢體血管再生效應 AAV-2肌注實驗動物4周后，依次循絲線縫扎處切開皮膚肉眼直視下觀察注射帶有不同基因的4種不同病毒的血管再生效果，結果發現注射同時攜帶有人hAng1/VEGF165基因的病毒其再生血管豐富密集且管徑粗大，攜帶有人VEGF165基因的病毒再生血管稀疏且周圍組織水腫明顯，攜帶有人Ang1基因的病毒再生血管稀少，攜帶有人LacZ基因的病毒幾乎無再生血管，見圖1。

2.2 組織學檢測血管再生效應 實驗動物4周后肌組織切片經-SMA免疫組化染色，可見血管平滑肌染成了棕色如圖2所示。-SMA陽性血管密度計數發現AAV-2-hAng1/VEGF165組為（9.8±5.2）個/mm2組明顯高于AAV-2-hVEGF165組（6.2±3.0）個/mm2、AAV-2-hAng1組（5.1±2.1）個/mm2（t=4.21、5.96，P<0.05）、AAV-2-LacZ組（1.8±0.2）個/mm2（t=11.46，P<0.05）；AAV-2-hVEGF165組、AAV-2-hAng1組-SMA陽性血管密度計數均高于AAV-2-LacZ組（t=6.35、4.98，P<0.05）。

3 討論

隨著人民生活條件的好轉，飲食結構的改變，人均壽命的延長等社會人口老年化的發展，使得缺血性血管疾病如冠心病，動脈硬化閉塞癥，糖尿病足、血栓閉塞性脈管炎等為代表的疾病日益增多，嚴重影響人民的生活質量，部分還威脅到生命。文獻[9]記載，在我國動脈缺血性疾病其總發病率為0.74%，是血管外科常見病。目前外科治療對于廣泛的動脈狹窄和閉塞病癥沒有很好的療效，隨著對缺血性疾病的深入研究，以及分子生物學和遺傳學的進展，基因治療在血管疾病治療中是備受矚目的新方法，利用轉基因技術刺激缺血部位生長新生血管成為治療缺血性血管疾病的一種主要措施[10]。

目前對于嚴重缺血性疾病的基因治療，是使用病毒載體、非病毒載體或質粒載體將VEGF直接轉染到缺血組織中或注射到血管內，利用細胞旁分泌VEGF的途徑，促進病變部位側支血管的建立[11-20]。

本研究用攜帶人VEGF165基因的病毒載體AAV-2-hVEGF165，攜帶人Ang1基因的病毒載體AAV-2-hAng1，攜帶-半乳糖苷酶（-gal）基因的rAAV-2-LacZ和同時攜帶人Ang1/VEGF165基因的病毒載體AAV-2-hAng1/VEGF165直接注射新西蘭雄性大白兔缺血的四肢肌組織中，4周后利用肉眼觀察和免疫組織化學法檢測它們之間的血管再生效應。從本實驗可以看出同時攜帶兩種基因AAV-2在肌組織中高效表達，發揮最強的血管再生效應，單獨攜帶人Ang1、VEGF16兩種基因的AAV-2在肌組織也具有促進血管再生效應。因此，hAng1/VEGF165可協同性地促進缺血肢體的血管生成、動脈生成、血流量的恢復，并可能具有改變血管通透性的作用，其可能作為血管再生相關疾病的新的治療方法，具有潛在的廣泛的臨床應用前景。

參考文獻

[1] Salaru D L，Arsenescu-Georgescu C，Chatzikyrkou C，et al.

Midkine， a heparin-binding growth factor， and its roles in atherogenesis and inflammatory kidney diseases[J].Nephrol Dial Transplant，2016，31（11）：1781-1787.

[2] Chen C K，Yu W H，Cheng T Y，et al.Inhibition of VEGF165/VEGFR2-dependent signaling by LECT2 suppresses hepatocellular carcinoma angiogenesis[J].Sci Rep，2016，6（2）：31398-31409.

[3] Jarmul J，Pletcher M J，Hassmiller L K，et al.Cardiovascular Genetic Risk Testing for Targeting Statin Therapy in the Primary Prevention of Atherosclerotic Cardiovascular Disease： A Cost-Effectiveness Analysis[J].Circ Cardiovasc Qual Outcomes，2018，11（4）：e4171-e4195.

[4] Guyot M，Pages G.VEGF Splicing and the Role of VEGF Splice Variants： From Physiological-Pathological Conditions to Specific Pre-mRNA Splicing[J].Methods Mol Biol，2015，1332（1）：3-23.

[5] Tarallo V，De Falco S.The vascular endothelial growth factors and receptors family： Up to now the only target for anti-angiogenesis therapy[J].Int J Biochem Cell Biol，2015，64（9）：185-189.

[6] Shyu K G，Manor O，Magner M，et al.Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemic hindlimb[J].Circulation，2014，98（19）：2081-2087.

[7] Zhao M，Yu Z，Li Z，et al.Expression of angiogenic growth factors VEGF， bFGF and ANG1 in colon cancer after bevacizumab treatment in vitro：A potential self-regulating mechanism[J].Oncol Rep，2017，37（1）：601-607.

[8] Park J，Kim J Y，Hwang S R，et al.Chemical Conjugate of Low Molecular Weight Heparin and Suramin Fragment Inhibits Tumor Growth Possibly by Blocking VEGF165[J].Mol Pharm，2015，12（11）：3935-3942.

[9] Kazemi M，Carrer A，Moimas S，et al.VEGF121 and VEGF165 differentially promote vessel maturation and tumor growth in mice and humans[J].Cancer Gene Ther，2016，23（5）：125-132.

[10] Zarbin M A.Anti-VEGF Agents and the Risk of Arteriothrombotic Events[J].Asia Pac J Ophthalmol，2018，7（1）：63-67.

[11] Gremmels H，Teraa M，Quax P H，et al.Neovascularization capacity of mesenchymal stromal cells from critical limb ischemia patients is equivalent to healthy controls[J].Mol Ther，2014，22（11）：1960-1970.

[12] Ryu J K，Cho C H，Shin H Y，et al.Combined angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor gene transfer restores cavernous angiogenesis and erectile function in a rat model of hypercholesterolemia[J].Mol Ther，2016，13（4）：705-715.

[13] Hou J，Wang L，Wu Q，et al.Long noncoding RNA H19 upregulates vascular endothelial growth factor A to enhance mesenchymal stem cells survival and angiogenic capacity by inhibiting miR-199a-5p[J].Stem Cell Res Ther，2018，9（1）：109-120.

[14] Shin S H，Lee J，Ahn D G，et al.Co-delivery of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 using injectable microsphere/hydrogel hybrid systems for therapeutic angiogenesis[J].Pharm Res，2013，30（8）：2157-2165.

[15] Wang C，Zhang B，Lin Y，et al.Effects of Adenovirus-mediated VEGF165 Gene Therapy on Myocardial Infarction[J].Ann Clin Lab Sci，2018，48（2）：208-215.

[16] He L，Liu C，Sun C，et al.Wu-Tou Decoction Inhibits Angiogenesis in Experimental Arthritis by Targeting VEGFR2 Signaling Pathway[J].Rejuvenation Res，2018，12（5）：706-713.

[17] Jain A，Kratimenos P，Koutroulis I，et al.Effect of Intranasally Delivered rh-VEGF165 on Angiogenesis Following Cerebral Hypoxia-Ischemia in the Cerebral Cortex of Newborn Piglets[J].Int J Mol Sci，2017，18（11）：273-280.

[18] Galli F，Artico M，Taurone S，et al.Radiolabeling of VEGF165 with 99mTc to evaluate VEGFR expression in tumor angiogenesis[J].Int J Oncol，2017，50（6）：2171-2179.

[19] Quan R，Du W，Zheng X，et al.VEGF165 induces differentiation of hair follicle stem cells into endothelial cells and plays a role in in vivo angiogenesis[J].J Cell Mol Med，2017，21（8）：1593-1604.

[20] Feng Q，Zhang C，Lum D，et al.A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis[J].Nat Commun，2017，8（1）：14450-14466.

（收稿日期：2018-07-09） （本文編輯：周亞杰）