兔耳創傷后創面早期外用干擾素與法舒地爾預防瘢痕增生的實驗研究

羅坤　喬柱

[摘要]目的：本實驗觀察兔耳創傷后創面立即外用干擾素與法舒地爾預防瘢痕增生的療效。方法：選擇健康的新西蘭大耳白兔，制作兔耳創傷模型48只，隨機分為A，B，C三組，每組16只共計32個創面，A組外用干擾素霜，B組外用法舒地爾霜，C組為生理鹽水對照組。術后第一天起用藥至4周后兔耳上皮化，切取瘢痕組織計算瘢痕增生指數，觀察masson染色膠原纖維的形態分布及成纖維細胞數量。結果：A組與B組之間差異有統計學意義（P<0.05），A組與C組、B組與C組之間差異皆具有統計學意義，差異顯著（P<0.01）。結論：兔耳創傷后創面立即外用干擾素與法舒地爾能有效預防抑制瘢痕增生。

[關鍵詞]干擾素；法舒地爾；創傷；成纖維細胞；增生性瘢痕；實驗研究

[中圖分類號]R619⁺.6 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）03-0074-03

增生性瘢痕是整形外科研究的難點和熱點，臨床治療較為困難，一般采用手術切除輔以其它方法如藥物注射、激光、按摩、加壓、硅凝膠膜等。經臨床證實如干擾素，鈣通道阻滯劑等藥物較為有效。Lee，京薩等通過一系列研究證實肌注或者外用鈣通道阻滯劑均能有效抑制兔耳瘢痕增生。依此，本實驗利用兔耳作為瘢痕模型，對兔耳創傷后即用干擾素與法舒地爾至創面上皮化愈合，觀察其預防抑制瘢痕增生的療效。

1材料和方法

1.1實驗動物：本實驗兔48只由雅安職業技術學院實驗中心提供，兔齡8～12個月，兔耳完好，雌雄不計，體重為2.0～2.5kg。

1.2實驗儀器和試劑：實驗所需手術的器械由雅安職業技術學院動物實驗中心提供，相機（自備），干擾素（北京凱英科技有限公司），鹽酸法舒地爾（成都華宇制藥有限公司），0.9%氯化鈉注射液（成都青山利康藥業有限公司）。

1.3創傷模型的制作：依據李薈元研究設計的瘢痕模型制作方法，將兔耳腹側全層皮膚去除1.5cm×1.5cm，并刮除其軟骨膜。

1.4實驗動物分組：將48只實驗兔隨機分成3組，每組16只，每只兔耳造模一個共創傷模型32個。實驗組A組外用干擾素α-2b（將凡士林99g加1g干擾素α-2b注射液，制成1%的干擾素α-2b霜），B組外用法舒地爾（將凡士林99g加1g法舒地爾注射液，制成1%的法舒地爾霜），C組生理鹽水為對照組（將凡士林99g加1g無菌生理鹽水，制成1%的生理鹽水霜）。

1.5用藥方法：術后第1天，A組外用干擾素α-2b霜每日1次均勻薄層涂抹在創面上，至兔耳上皮化愈合共計4周。B組每日1次外用法舒地爾霜與C組每日1次生理鹽水霜，至兔耳上皮化愈合共4周。

1.6標本切取及處理：實驗第29天處死實驗動物，在嚴格無菌條件下切取兔耳標本，帶有部分正常皮膚軟組織和軟骨膜。10%的甲醛溶液固標本定，石蠟包埋，進行HE染色和Msson染色。

2觀察指標

2.1大體方面觀察：每天觀察并拍照記錄創面肉芽生長、創面愈合后瘢痕形成情況如：組織的顏色、質地、大小、厚度等。分別在實驗第7天、14天、28天記錄數據并分析，在第28天時創面上皮化，大體表現：根據溫哥華瘢痕評分標準記錄評分。

2.2瘢痕增生指數（HI）測量：在低倍鏡下測微尺測出正常皮膚表面至軟骨表面的厚度b，測出瘢痕表面至軟骨表面的厚度a，依據Morris等提出的瘢痕增生指數HI=a/b即得出結果。

2.3成纖維細胞計數FBh在HE染色標本中，低倍顯微鏡下尋找顯示最清楚、成纖維細胞數最多的區域，通過高倍鏡下觀察4個不重復的不同區域視野并目測計數，得到的結果取均數，此數即為該實驗動物的成纖維細胞數目（Weidner法）。

3統計方法

本實驗采用PASW Statistics18（SPSS18.0）軟件進行統計分析，組間比較采用了t檢驗，并且按檢驗水準a=0.05，P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01差異顯著；P>0.05則差異無統計學意義，可認為實驗組與對照組對瘢痕的預防抑制作用無明顯差異。

4結果

4.1一般觀察：實驗第28天時，創面皆愈合形成瘢痕，干擾素和法舒地爾不影響創面的愈合，且愈合時間差異無統計學意義。實驗A組：肉眼可見瘢痕不超過手術范圍，瘢痕質地平軟，顏色淡，斑塊體積小；B組：瘢痕不超過手術范圍，質地稍平軟，顏色稍淡，斑塊體積較小；C組：瘢痕增生高出皮膚表面但不超過手術范圍，質地硬，顏色紅，瘢痕斑塊體積大。

4.2 HE染色觀察：A組、B組鏡下可見創傷區表皮和真皮稍顯增厚，細胞層次少，表皮的厚薄程度不均，瘢痕厚度略高于周圍正常皮膚，瘢痕內可見呈梭形成纖維細胞和炎細胞；C組表皮和真皮增生明顯，細胞層次明顯增多，可見大量不規則的梭型成纖維細胞呈漩渦狀，可見大量的成纖維細胞和炎細胞浸潤。

4.3 Masson染色觀察：A組、B組Masson染色觀察膠原致密，形態纖細，膠原纖維排列整齊；C組膠原纖維藍染顏色深，膠原酥松粗大，膠原纖維排列紊亂。

4.4瘢痕增生指數及成纖維細胞計數比較：軟件分析統計結果如表1、表2。由表1可見：實驗A組和實驗B組比較P<0.05，差異有統計學意義，實驗A組瘢痕增生不明顯，實驗B組輕度瘢痕增生。實驗A組、B組和對照C組比較P<0.01，C組瘢痕增生明顯。由表2可見：實驗A組和實驗B組比較P<0.05，差異有統計學意義，實驗A組成纖維細胞計數少于實驗B組。實驗A組、B組和對照C組比較P<0.01，A組、B組成纖維細胞計數明顯少于C組。

5討論

深度創傷后創面成纖維細胞大量增生，膠原纖維基質過度沉積導致皮膚纖維化，形成突出表面的瘢痕組織。增生性瘢痕之所以治療困難，是因為至今沒有一個很好的研究模型，對發病機理不清。建立有效的動物瘢痕模型為研究瘢痕提供可靠的方法，李薈元研究探索兔耳作為研究瘢痕的動物模型。朱桂英等進一步研究如何選擇兔耳創傷部位及深度，術后處理方法，為增生性瘢痕的研究提供了成功率更高的兔耳模型。在兔耳可作為有效的瘢痕模型的研究背景下，對兔耳創傷后即用干擾素與法舒地爾至創面上皮化愈合，觀察其預防抑制瘢痕增生的療效。

干擾素可誘導細胞分化，抑制合成膠原蛋白并促進其降解，抑制成纖維細胞的增殖，拮抗轉化生長因子β的正性調節作用，抑制α平滑肌肌動蛋白的合成，從而抑制瘢痕增生。鈣通道阻滯劑主要作用于多種酶如：Rho激酶（三磷酸鳥苷結合蛋白，可抑制細胞增殖，參與重構細胞骨架，在細胞分化遷移凋亡發揮作用）、MLCK（肌球蛋白輕鏈激酶，屬于鈣調素依賴酶，催化肌球蛋白磷酸化，激活肌球蛋白ATP酶引起平滑肌收縮）、PKA和PKC（cAMP依賴蛋白激酶A、C使肌細胞生成素磷酸化，抑制肌細胞生成素與DNA的結合能力，阻止細胞分化為肌纖維）等多種酶，抑制細胞內游離鈣離子活動，減輕炎癥反應從而減輕組織損傷。許寧等研究表明，鈣通道阻滯劑維拉帕米增強Smad7的表達，抑制成纖維細胞α-Smad7mRNA及合成細胞外基質。劉沖等認為，鈣通道阻滯劑維拉帕米能夠改變損傷處血管分布影響瘢痕形成。鹽酸法舒地爾為新型鈣通道阻滯劑，通過抑制Rho激酶、抑制PKA、C活性，減輕組織重構，有效地抑制成纖維細胞的增殖而抑制瘢痕。

本實驗從大體及細胞學對兔耳創傷后創面立即外用干擾素與法舒地爾進行研究，干擾素與法舒地爾皆能預防抑制瘢痕增生，干擾素抑制瘢痕的作用強于法舒地爾，但干擾素副作用較多，不能誘導成纖維細胞凋亡而易復發；法舒地爾副作用少，對健康皮膚無明顯副作用而優于干擾素。本實驗表明，兔耳創傷后創面立即外用干擾素與法舒地爾能預防抑制瘢痕增生，但還有待進一步研究如用藥頻次、用量以及用藥的最佳濃度和停藥后治療效果的觀察。