低氧后處理活化腺苷A2a受體抑制皮瓣微血管內皮細胞凋亡

曾建坤　林煌　李斌斌等

[摘要]目的：本研究致力于探求腺苷A_2a在低氧后處理抗凋亡中的作用。方法：從人上瞼皮膚組織中分離培養原代人皮膚微血管內皮細胞，經6h低氧培養后，置于正常氧環境培養12h；或者經過5min常氧/5min低氧，3次循環，即低氧后處理，之后再常氧培養11.5h。結果：細胞凋亡比例和細胞凋亡相關蛋白（Bax/Bcl-2和caspase-3）表達量增高，均證明低氧/復氧可引起嚴重的損傷（P<0.05）。低氧后處理和選擇性A_2a受體激動劑——CGS-21680均可降低前兩者（P<0.05）。同時，低氧后處理和CGS-21680均明顯活化了腺苷A_2a受體（P<0.05）。數據分析顯示，凋亡的增加量與A_2a受體蛋白的表達增加量呈顯著負相關（r2=0.8177，P<0.0001）。結論：低氧后處理通過活化皮膚微血管內皮細胞表面的A_2a受體發揮抑制凋亡的作用。

[關鍵詞]游離皮瓣；人皮膚微血管內皮細胞；凋亡；低氧后處理；腺苷A_2a受體

[中圖分類號]R622 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）03-0070-04

游離皮瓣移植被廣泛用來進行器官再造或覆蓋大面積的組織缺損。手術過程中缺血再灌注不可避免地造成游離皮瓣損傷。Eltzschig研究發現，缺血再灌注可以導致血管內皮細胞凋亡。Bax作為一種促凋亡因子，促進細胞色素C從線粒體釋放。細胞色素C進入胞質，活化caspase-9，后者又激活caspase-3，啟動凋亡程序。抗凋亡因子Bcl-2能夠抑制Bax的活化和細胞色素C的釋放，從而抑制凋亡。研究顯示，Bax/Bcl-2比值增加可以反映caspase體系的活化程度，后者在凋亡程序中出于核心地位。

2003年，Zhao等人在試驗中采用缺血后處理減輕了缺血再灌注引起的急性心梗面積。Moon首次報道了缺血后處理有效減輕了兔皮瓣的再灌注損傷，這一研究將缺血后處理的應用推廣到符合組織。

2007年證實，缺血后處理的抗再灌注損傷作用與心臟的腺苷A_2a受體活化有關。一系列關于缺血后處理的廣泛研究促進了針對細胞的類似保護措施——低氧后處理的出現。

我們推測低氧后處理通過活化微血管內皮細胞的腺苷A_2a受體抑制凋亡。本研究采用我們團隊之前報道過的人皮膚微血管內皮細胞模型，低氧/復氧和低氧后處理分別模擬游離皮瓣移植過程中的缺血/再灌注和缺血后處理。本研究的目的是：①探究低氧后處理是否能夠抗皮膚微血管內皮細胞凋亡；②觀察不同分組的A_2a受體表達水平是否有變化，如果有變化；③研究受體活化與凋亡之間的關系。

1材料和方法

1.1材料：原代人皮膚微血管內皮細胞，實驗采用的人皮膚微血管內皮細胞來自重瞼術后切除的上瞼皮膚組織；CD31 MicroBeads Kit（Miltenyi Biotec，Macs，Germany）；CGS-21680（Abcam，Cambridge，England）；FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒I（BD Biosciences，BD Pharmingen^TM，USA）；抗兔Bax抗體，抗兔Bcl-2抗體，抗兔caspase-3抗體，堿性磷酸酶的羊抗兔IgG以及GAPDH（Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，USA）。

1.2方法

1.2.1實驗分組處理：細胞隨機分為4組，分別進行如下處理：①對照組（CON）：細胞于常氧完全培養基內培養18h；②低氧/復氧組（H/R）：細胞在含90%N₂+5%CO₂+5%O₂的低氧培養箱中培養6h（低氧），之后在正常氧含量的培養基中培養12h（復氧）；③低氧后處理組（HPC）：低氧6h結束之后，細胞立即轉移至常氧環境5min，結束后馬上轉回低氧培養箱5min，執行3個循環后再常氧培養11.5hin：；④H/R+CGS-21680組（H+C）：低氧和復氧前分別向培養基內加入1μM CGS-21680，其他處理同H/R組。

1.2.2免疫熒光染色檢測A_2a受體：復氧結束后，經福爾馬林固定過的細胞用0.1%Triton X-100通透15min，再用3%牛血清白蛋白室溫封閉30min。抗腺苷A_2a抗體按1：100稀釋后濕盒內4℃孵育過夜。PBST洗滌，1：200稀釋后二抗室溫孵育。最后DAPI染核，封片。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察凋亡細胞。

1.2.3流式細胞分析術檢測凋亡比例：使用FITC-AnnexinV凋亡檢測試劑盒Ⅰ檢測細胞的凋亡比例。冷PBS洗滌細胞2次后胰蛋白酶處理。FBS終止胰蛋白酶消化作用。218g離心5min。1X結合緩沖液重懸沉淀至1×106細胞/ml。每100μl液體內加入5μl 0f Annexin V FITC和5μl PI。室溫避光孵育15min。流式上機前加入200μl的1X結合緩沖液。另設兩組分別不加Annexin V FITC或PI，以調整流式細胞儀。

1.2.4蛋白免疫印跡每組處理結束，冷PBS洗滌細胞三次。每孔加入濃度為含150ml/1蛋白酶抑制劑的細胞裂解液。收集細胞后4℃離心15min。用試劑盒定量蛋白，調整蛋白濃度。蛋白樣品煮沸5min，每孔上樣25μg蛋白。將靶蛋白轉移至硝酸纖維素膜。用以下稀釋的一抗孵育：抗兔Bax，抗兔Bcl-2，抗兔caspase-3以及GAPDH。二抗為堿性磷酸酶的羊抗兔IgG。Odyssey成像系統掃膜。

1.3統計分析：數據均采用x±s方式表示。單因素方差分析方法進行組間比較。Student-Newman-Keuls q test進行組內比較。統計分析使用SPSS19.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。P<0.05被認為具有統計學差異。

2結果

2.1低氧/復氧后行低氧后處理或CGS-21680處理，均能減少凋亡：如圖1，流式細胞分析結果顯示低氧/復氧組凋亡比例顯著高于對照組（27.76%±1.38%vs0.90%±0.31%，P<0.05），而低氧后處理組和H+C組凋亡比例分別降至16.47%±0.60%.7.63%±0.83%（P<0.05）。

為驗證低氧后處理是否具有抗凋亡效應，采用蛋白免疫印跡檢測Bax和Bcl-2的表達量。（圖2A、B）。與流式分析結果一致，低氧后處理和CGS-21680處理均降低了Bax/Bcl-2比值（圖2C）以及caspase-3表達量（圖2D），從而發揮抗凋亡效應。

2.2低氧/復氧后行低氧后處理或CGS-21680處理，均促進了A_2a受體表達：為進一步探究A_2a受體與凋亡相關因子的關系，我們檢測了各組中受體的表達量（圖3）。蛋白免疫印跡結果顯示，與H/R組（7.12±0.57）相比，HPC組和H+C組受體表達量分別增長至11.98±0.70（P<0.05）和16.46±2.47（P<0.05）。

2.3細胞凋亡與A_2a受體蛋白表達的關系：鑒于低氧后處理與腺苷A_2a受體激動劑對細胞凋亡和A_2a受體表達量的相似影響，我們假說：低氧后處理可能通過活化A_2a受體從而抑制細胞凋亡。以CON組為基準，我們計算了其余三組A_2a受體表達增加量和凋亡比例的減少量，并用Pearson相關計算兩變化量之間的關系。如圖4所示，凋亡比例增加量與A_2a受體表達相對增量呈密切的負相關關系（72=0.8177，P<0.0001），說明低氧后處理減輕低氧/復氧引起的細胞凋亡，至少部分原因是因為A_2a受體活化。

3討論

本研究證明低氧后處理減少人皮膚微血管內皮細胞凋亡比例和線粒體途徑細胞凋亡相關蛋白的表達，從而減輕復氧導致的損傷。此外，我們進一步證實低氧后處理抑制凋亡至少部分是通過活化A_2a受體實現的。

3.1缺血/再灌注經線粒體途徑導致皮膚微血管內皮細胞凋亡：凋亡的確切機制相當復雜，包括一系列能量依賴的分子事件。目前研究發現主要有兩條信號通路：死亡受體途徑和線粒體途徑。線粒體途徑起始于Bcl-2凋亡調節家族，如Bax和Bcl-2。本研究中，我們檢測了Bax/Bcl-2比值和caspase-3來反應凋亡。蛋白免疫印跡顯示，與CON組相比，低氧/復氧導致Bax/Bcl-2比值升高，caspase-3表達增多，即導致了更為嚴重的凋亡。流式細胞分析也顯示出了同樣的趨勢。之前有報道缺血再灌注可導致組織和器官的血管內皮細胞凋亡。我們的研究結果與之相同。

3.2腺苷A_2a受體介導線粒體途徑細胞凋亡：以往研究證實，內皮細胞在心肌缺血損傷的始動和進展中具有核心作用。因此，減輕血管內皮細胞損傷在保護游離皮瓣的缺血再灌注損傷中具有重要作用。已有許多研究致力于減輕缺血再灌注引起的內皮細胞凋亡，目前，腺苷成為新的研究熱點。腺苷是腺嘌呤核苷酸的中間產物，當供氧減少或能量消耗增加時可作為一種活性物質。內皮細胞中腺苷代謝非常活躍，具有強大的吸收和釋放核苷的能力，在機體缺血時可以作為重要的腺苷來源。反之，腺苷也能通過活化內皮細胞的膜受體調節內皮細胞的功能。腺苷受體屬于G蛋白偶聯7跨膜受體，包括A₁，A_2a，A_2b和A₃亞型。最近，有研究者已經確認藥物或疾病誘導的凋亡與腺苷A^2a受體的關系。2013年，Soleimani報道A_2a受體經線粒體途徑在凋亡過程中起作用。與之類似，Huang也報道了A_2a受體與線粒體依賴的細胞凋亡相關。但是不同來源的內皮細胞具有不同的生物學特征，迄今未有人皮膚微血管內皮細胞與A_2a受體關系的報道。本研究檢測了A_2a受體蛋白的相對表達量，探究不同組間表達是否有差異。

3.3低氧后處理通過活化腺苷A_2a受體減輕缺血再灌注損傷：我們團隊之前已經報道了體外構建人皮膚微血管內皮細胞的低氧后處理模型，為研究血管內皮細胞凋亡與低氧后處理的關系提供了模型基礎。研究中，我們確定了后處理的流程：5min低氧/5min復氧，共3次循環。不同于Wang報道的5min低氧/5min復氧，共2次循環。可能是因為細胞部位、來源、培養環境不同所致。本研究中，低氧/復氧顯著提高了凋亡比例，低氧后處理又可減輕凋亡比例，證實了低氧后處理在人皮膚微血管內皮細胞的抗凋亡作用。研究結果與Vetrovoi報道的結果相同，他報道低氧后處理過程中涉及凋亡相關進程。

大量關于低氧后處理抗凋亡分子機制的研究已取得重大進展。2009年，Leconte證實了低氧可保護神經元細胞，并指出HIF-1α所起的作用。此外，Wang發現低氧后處理通過減少ON00^-的形成減輕心肌細胞凋亡。然而，至今沒有被學術界公認的統一理論。

本研究著重關注A_2a受體活化與低氧后處理的關系。蛋白免疫標記結果顯示，與H/R組相比，HPC組與H+C組A_2a受體活化顯著增加。并且統計分析證實凋亡比例增加量與A_2a受體表達相對增量呈密切的負相關關系。綜上，A_2a受體活化至少是低氧后處理起保護作用的原因之一。

4結論

與H/R組相比，低氧后處理降低了凋亡比例，活化了A_2a受體，同時改變了線粒體途徑凋亡相關蛋白的表達，使Bax/Bcl-2比值減小，caspase-3表達減少。我們得出結論：低氧后處理激活A_2a受體，經線粒體凋亡途徑減輕低氧/復氧引起的細胞凋亡。本研究將為低氧后處理抗凋亡機制研究提供了新的視角，為整形外科提高游離皮瓣移植成活率創造了理論基礎。