微等離子體與點(diǎn)陣Er：YAG激光（2940nm）治療兔耳增生性瘢痕的療效比較

劉英琦　曹莫　任志鑫

[摘要]目的：探討微等離子體與點(diǎn)陣Er：YAG激光（2940nm）對(duì)兔耳增生性瘢痕的治療效果。方法：同種屬雌性新西蘭大耳白兔6只，于每只兔耳腹側(cè)面中段制作增生性瘢痕模型。28d后，將造模成功的瘢痕塊隨機(jī)分為3組，分別行微等離子體、點(diǎn)陣激光治療和空白對(duì)照，治療后27d取材，進(jìn)行HE、Masson和天狼猩紅染色，觀察各組瘢痕組織中成纖維細(xì)胞數(shù)目、膠原分布特征及Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的構(gòu)成比。結(jié)果：兩個(gè)治療組瘢痕組織變軟變平且彈性增加，成纖維細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組減少，以Plasma組更為明顯；膠原纖維的形態(tài)及排列向正常皮膚中的形態(tài)及排列轉(zhuǎn)變，Ⅲ型膠原纖維的比例均增加，兩治療組間無(wú)顯著差異。結(jié)論：微等離子體與點(diǎn)陣Er：YAG激光（2940nm）治療兔耳增生性瘢痕均有效，且在抑制瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞增生方面，微等離子體具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。

[關(guān)鍵詞]激光；瘢痕；成纖維細(xì)胞；膠原；兔；微等離子體

[中圖分類(lèi)號(hào)]R619⁺.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）03-0066-04

成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積是增生性瘢痕的病理學(xué)基礎(chǔ)。干預(yù)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)，改變細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分：Ⅰ、Ⅲ型膠原的排列形態(tài)，可治療增生性瘢痕。點(diǎn)陣Er：YAG激光（2 940nm）目前己在治療凹陷性瘢痕方面取得了良好療效。微等離子體射頻技術(shù)也已成功用于細(xì)小皺紋、妊娠及凹陷性瘢痕的治療，且已證實(shí)二者在刺激膠原蛋白再生及改善膠原纖維排列方面療效突出。因此，我們采用微等離子與點(diǎn)陣Er：YAG激光治療兔耳增生性瘢痕，通過(guò)觀察各組兔耳增生性瘢痕的病理組織切片中成纖維細(xì)胞數(shù)目、膠原纖維排布特征，以及Ⅰ、Ⅲ型膠原構(gòu)成比例的變化來(lái)探討其對(duì)增生性瘢痕的治療是否有效，并比較二者的療效。

1資料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)備：同種屬新西蘭大白兔6只，雌性，體重（2.5±0.20）kg，采購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（冀）2008-2-001。實(shí)驗(yàn)設(shè)備：①Plasma微等離子射頻儀（Alma Lasers，Israel）；②點(diǎn)陣Er：WAG激光（2 940hm）：（Asclepion MCL30 Dermablate，German）；③偏光顯微鏡，（Olympus，Japan）；④實(shí)驗(yàn)試劑：天狼猩紅（Sigma，America）。

1.2動(dòng)物模型制作：參照李薈元等動(dòng)物增生性瘢痕模型的制作方法，速眠新、氯胺酮以1：1的比例混合后按0.2ml/kg肌注，全麻。于每只兔耳腹側(cè)面中段，用圓形環(huán)鉆沿長(zhǎng)軸避開(kāi)血管，各做4個(gè)直徑為8mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，并刮除軟骨膜，共形成48個(gè)圓形創(chuàng)面（圖1）。創(chuàng)面1周左右上皮化后，去除痂皮，造模術(shù)后28d左右達(dá)到增生高峰，瘢痕塊顏色發(fā)紅、質(zhì)硬、明顯突起于周?chē)つw，但未超出原術(shù)野范圍（圖2a-a，2b-b）。隨機(jī)切取部分瘢痕組織，HE染色可見(jiàn)過(guò)度增殖的成纖維細(xì)胞、微血管、膠原纖維，認(rèn)為造模成功。

1.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程：造模術(shù)后28d，共形成增生性瘢痕42處，隨機(jī)分為3組：①Plasma治療組：無(wú)套管治療頭，0.6ms，80w，1遍；②點(diǎn)陣Er：WAG激光（2 940hm）治療組：微孔點(diǎn)陣模式，光斑13mm×13mm，分9層打孔，能量密度162J-/em²。③空白對(duì)照組：不做治療。治療后創(chuàng)面表面外涂紅霉素眼膏，繼續(xù)分籠避光飼養(yǎng)，未見(jiàn)水皰、紫癜及血皰等，恢復(fù)過(guò)程中未見(jiàn)感染。

1.4觀察和測(cè)量：造模術(shù)后55d，觀察并記錄各組兔耳創(chuàng)面愈合、瘢痕增生情況及經(jīng)治療后瘢痕顏色、質(zhì)地、厚度變化。麻醉成功后，11號(hào)尖刀切取兔耳增生性瘢痕組織對(duì)應(yīng)的全層兔耳，即刻放入中性福爾馬林緩沖固定液中，并分組標(biāo)記。4℃固定2周后，以全層兔耳為斷面，縱向截取瘢痕標(biāo)本，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。①HE染色：在400倍普通光學(xué)顯微鏡下觀察兔耳增生性瘢痕組織的特征性結(jié)構(gòu)；每張兔耳瘢痕組織切片中央及兩側(cè)各隨機(jī)選取2個(gè)不重疊視野，分別記錄鏡下目測(cè)到的成纖維細(xì)胞數(shù)目；②Masson染色：400倍普通光學(xué)顯微鏡下觀察兔耳增生性瘢痕組織中膠原纖維形狀，密度以及排列走向情況；③天狼猩紅染色：將空白切片置于1%飽和苦味酸天狼星紅溶液染色1h，流水沖洗5min。蘇木精復(fù)染2min，常規(guī)分化返藍(lán)，流水沖洗，常規(guī)脫水，透明，封片。在400倍偏振光顯微鏡下觀察，Ⅰ型膠原纖維為粗大明亮且不均勻的紅色或黃色纖維，顯示很強(qiáng)的雙折光性，排列密集無(wú)序；Ⅲ型膠原纖維為纖細(xì)的綠色纖維，顯示弱的雙折光性，呈疏網(wǎng)狀分布于Ⅰ型膠原纖維周?chē)瑪z片，麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析：以綠色纖維代表Ⅲ型膠原纖維，分析出圖像中綠色纖維的陽(yáng)性總面積；以黃色和紅色纖維代Ⅰ型膠原纖維，分析出圖像中紅色黃色纖維的陽(yáng)性總面積。將Ⅲ型膠原纖維的陽(yáng)性總面積除以Ⅰ型膠原纖維的陽(yáng)性總面積，計(jì)算出Ⅲ型膠原纖維比例。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組兔耳增生性瘢痕組織中不同視野下單位面積內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)目，Ⅲ型膠原所占比例，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)分組的方差分析，以P<0.05作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1大體觀察：對(duì)照組：瘢痕組織色紅、質(zhì)硬，突起于皮膚表面，但未超出原手術(shù)范圍；Plasma治療組：治療后即刻可見(jiàn)瘢痕組織表面均勻分布的焦黃色點(diǎn)狀微孔、少量點(diǎn)狀滲血及淡黃色滲液。創(chuàng)面自行結(jié)痂，10d左右完全脫落。取材前可觀察到瘢痕顏色變淺、質(zhì)地更接近周?chē)Ｆつw（圖2a、2b）。點(diǎn)陣Er-YAG激光治療組：治療后即刻可見(jiàn)均勻分布的白色至微黃的針尖狀氣化孔，無(wú)明顯滲出。痂皮較薄，一周左右自行脫落。至取材前可見(jiàn)瘢痕組織體積縮小，顏色較對(duì)照組變淡，質(zhì)地平軟，彈性增加（圖2b-a）。

2.2病理染色結(jié)果

2.2.1 HE染色：對(duì)照組：成纖維細(xì)胞大量增生且排列無(wú)序，微血管增生明顯（圖3a），成纖維細(xì)胞數(shù)（77.14±9.304）個(gè)/視野；Plasma治療組：成纖維細(xì)胞增生受抑，數(shù)目減少（圖3b），（59.12±10.344）個(gè)/視野；點(diǎn)陣激光治療組：成纖維數(shù)目變少，排列有序（圖3c），（66.00±7.943）個(gè)/視野。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，3組標(biāo)本鏡下單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)目有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=48.324，P=0.000<0.01）；SNK法多重比較結(jié)果顯示，三組標(biāo)本中任意兩組之間總體均數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），微等離子組較點(diǎn)陣激光組成纖維細(xì)胞數(shù)減少更為明顯。

2.2.2 Masson染色結(jié)果：對(duì)照組膠原纖維大量增生，形狀粗大且排布紊亂，可見(jiàn)旋渦結(jié)構(gòu)（圖4a）。兩治療組膠原纖維變細(xì)長(zhǎng)且較對(duì)照組排列疏散并趨于一致（圖4b、4c）。

2 2.3偏光顯微鏡觀察與圖象分析：對(duì)照組瘢痕組織中，膠原纖維分布密集且無(wú)序，黃色粗大的Ⅰ型膠原纖維呈叢束狀分布，排列無(wú)序，粗細(xì)不均，約占整個(gè)視野的59.2%，呈細(xì)絲狀綠色的Ⅲ型膠原纖維呈網(wǎng)疏狀分布于Ⅰ型膠原周?chē)s占（40.8±4.13）%（圖5a）；微等離子組：膠原纖維排列較對(duì)照組有序，且方向趨于一致，Ⅲ型膠原比例增加，約占（45.9±3.07）%（圖5b）。點(diǎn)陣激光組，膠原纖維分布疏散，排布漸規(guī)則，Ⅲ型膠原比例較對(duì)照組亦明顯增加，約占（44.4±3.06）%（圖5c）。不同處理組的兔耳增生性瘢痕組織中Ⅲ型膠原所占比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=5.745，P=0.008）；SNK法多重比較結(jié)果顯示，除了微等離子組與點(diǎn)陣激光組之間總體均數(shù)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余任兩組總體均數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），可認(rèn)為微等離子與點(diǎn)陣激光均能使兔耳瘢痕組織中Ⅲ型膠原比例增加，但二者無(wú)明顯區(qū)別。

3討論

增生性瘢痕形成的實(shí)質(zhì)是成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，膠原蛋白的過(guò)度合成大大超過(guò)其分解代謝的速度，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積。作為細(xì)胞外間質(zhì)的主要成分，Ⅰ、Ⅲ型膠原起著最為重要的支撐作用。Ⅰ型膠原是早期創(chuàng)面瘢痕愈合的基礎(chǔ)，占據(jù)著整個(gè)瘢痕組織，抗張力性很強(qiáng)，決定了組織僵硬度。Ⅲ型膠原是正常皮膚組織中網(wǎng)狀纖維的主要組成成分，較前者伸展性和柔軟度好，決定組織的彈性。

瘢痕增生的早期即可觀察到組織內(nèi)膠原含量、比例及結(jié)構(gòu)的改變，臨床針對(duì)膠原的治療可明顯改善瘢痕質(zhì)地，因此通過(guò)干預(yù)膠原增生及排布情況來(lái)控制瘢痕增生的方法是科學(xué)可行的。

近年來(lái)激光醫(yī)學(xué)及射頻技術(shù)以其安全性高、創(chuàng)傷小的優(yōu)勢(shì)成為治療病理性瘢痕的新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)將微等離子體與點(diǎn)陣Er：YAG激光（2940nm）可影響組織膠原的發(fā)生與發(fā)展這一特性運(yùn)用于增生性瘢痕的早期干預(yù)，即在早期就開(kāi)始誘導(dǎo)其膠原的含量及形態(tài)向正常組織轉(zhuǎn)化，以進(jìn)一步改善預(yù)后，探討療效是否確切并進(jìn)行對(duì)比，為臨床射頻技術(shù)和點(diǎn)陣激光治療增生性瘢痕提供理論依據(jù)。

微等離子是一項(xiàng)臨床治療瘢痕的新技術(shù)，它對(duì)成熟凹陷性瘢痕的療效已得到肯定，其單極射頻治療頭在即將接觸皮膚時(shí)利用射頻能量將空氣中氮?dú)夥肿樱杆俳怆x成高能量的第四態(tài)物質(zhì)發(fā)射出來(lái)，即等離子體，引起表皮至真皮淺層的點(diǎn)狀微剝并形成陣列樣排列的“熱修正區(qū)”，促使膠原新生及重排，以填平皮膚表面的細(xì)紋及凹陷。微等離子作用于皮膚后不會(huì)引起表皮的完全氣化，而是形成點(diǎn)狀痂皮，直到皮膚組織完全修復(fù)才脫落，減少了創(chuàng)面感染、色素沉著的發(fā)生率。陸雯麗等發(fā)現(xiàn)經(jīng)微等離子治療后患處水腫程度較輕，結(jié)痂時(shí)間及紅斑期較短，大大減少患者的停工時(shí)間，大量臨床實(shí)驗(yàn)均證明了微等離子體射頻技術(shù)對(duì)各類(lèi)原因?qū)е碌鸟：鄣挠行裕侵委燅：鄣囊豁?xiàng)安全且療效理想的技術(shù)。

點(diǎn)陣激光首先在治療萎縮性瘢痕方面取得了良好的療效，其原理為點(diǎn)陣式光熱作用：組織中水分子吸收能量后，產(chǎn)生矩陣狀排列的微熱損傷區(qū)，使周?chē)M織發(fā)生創(chuàng)傷愈合反應(yīng)來(lái)刺激真皮膠原再生、重構(gòu)，使治療區(qū)瘢痕更接近正常組織。點(diǎn)陣激光能精準(zhǔn)地汽化所到層次以上的皮膚，凝固層較薄，皮膚更快修復(fù)，術(shù)中痛感較微針等其他治療方法輕微，術(shù)后炎癥反應(yīng)輕、色素沉著發(fā)生率低，故更能被大眾所接受。但目前尚缺少治療增生性瘢痕方面的詳細(xì)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這兩種治療方法與對(duì)照組比較，均能提高兔耳增生性瘢痕中Ⅲ型膠原比例，改善膠原排列，并抑制成纖維細(xì)胞增生。兩種治療方法對(duì)比，微等離子治療后的兔耳增生性瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)減少較點(diǎn)陣組更為明顯，在提高Ⅲ型膠原比例方面兩治療組無(wú)明顯區(qū)別，這一結(jié)果為臨床Plasma治療增生性瘢痕提供了基礎(chǔ)理論證據(jù)。