睪酮對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎去勢雄兔的軟骨修復(fù)作用

熊華章，劉毅，王勝民，吳術(shù)紅，桑鵬

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

睪酮對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎去勢雄兔的軟骨修復(fù)作用

熊華章，劉毅，王勝民，吳術(shù)紅，桑鵬

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

目的 探討睪酮對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(KOA)睪丸切除(去勢)雄兔的軟骨修復(fù)作用。方法 將18只雄兔采用改良Hulth法建立右側(cè)KOA模型并去勢，8周時隨機處死6只，確認模型建立成功。將剩余12只兔隨機分為觀察組和對照組，每組6只。觀察組每隔2周肌注十一酸睪酮6 mg/kg，對照組同時肌注等量生理鹽水，共8周(4次)。分組處理第8、12、16周，采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清睪酮；分組處理第16周末處死，取出右股骨髁，肉眼觀察標本大體情況，采用免疫組化法檢測軟骨組織胰島素樣生長因子1(IGF-1)表達，并進行關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分。結(jié)果 兩組第8周血清睪酮水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，觀察組第12、16周血清睪酮水平均明顯高于對照組(P均<0.05)。對照組右膝關(guān)節(jié)明顯腫大，關(guān)節(jié)軟骨面變薄、粗糙，軟骨表面色澤變暗，潰瘍較深，邊緣骨贅形成明顯。觀察組右膝關(guān)節(jié)腫大程度輕于對照組，軟骨表面有光澤，可見小潰瘍和不規(guī)則裂隙。觀察組軟骨組織IGF-1陽性表達率高于對照組，Mankin′s評分低于對照組(P均<0.05)。結(jié)論 睪酮可促進KOA去勢雄兔的軟骨修復(fù)；其機制可能與促進IGF-1表達有關(guān)。

骨關(guān)節(jié)炎；膝關(guān)節(jié)；睪酮；去勢法；胰島素樣生長因子1；軟骨修復(fù)；兔

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成及滑膜炎為特征的疾病，目前尚無有效的治療藥物，膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)效果較好，但價格昂貴，且存在翻修等問題。研究證實，雌激素有預(yù)防關(guān)節(jié)退變和促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用，而關(guān)于雄激素對KOA是否具有軟骨修復(fù)作用鮮有報道[1，2]。為此，我們于2015年3～12月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性家兔18只，20周齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自遵義醫(yī)學(xué)院動物實驗基地。主要試劑及儀器：十一酸睪酮檢測試劑(EIA2352，德國DRG公司)，十一酸睪酮(生產(chǎn)批號：140812，浙江仙琚制藥股份有限公司)；胰島素樣生長因子1(IGF-1)單克隆抗體(BA0782，武漢博士德生物工程有限公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(SA3053-兔IgG，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；IMMULITE自動生化儀(美國DPC公司)，Image-proplus6.0圖像分析系統(tǒng)軟件(美國Media Cybernetics公司)，E200型顯微鏡(日本尼康公司)，SM2000R病理組織切片機(德國Leica公司)。

1.2 建模與分組處理 18只雄性家兔均建立右側(cè)KOA模型并進行睪丸切除(去勢)。建模方法：采用改良Hulth法。將3%戊巴比妥鈉以30 mg/kg沿兔耳緣靜脈注射麻醉，對右膝關(guān)節(jié)進行消毒處理，正中切開皮膚約3.5 cm；暴露膝關(guān)節(jié)腔，切斷右膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶(ACL)，并切除內(nèi)側(cè)半月板，確認前拉赫曼試驗陽性后縫合皮膚。去勢方法：在陰囊中部作一約2 cm長的縱行切口，分離雙側(cè)睪丸包膜，將睪丸擠出后結(jié)扎睪丸動脈及輸精管，切除睪丸，縫合皮膚。術(shù)后肌注青霉素20萬U/kg，連用3天；相同條件下自由攝食，每日驅(qū)趕，分籠飼養(yǎng)，飲水不限。8周后隨機選擇6只家兔，采用空氣栓塞法處死，采用Mankin′s評分評價OA 病理分期，確認中期KOA模型成功建立[3,4]。將剩余12只雄性家兔隨機分為觀察組和對照組，每組6只。觀察組每隔2周肌注十一酸睪酮6 mg/kg，對照組同時肌注等量生理鹽水，共8周(4次)。

1.3 相關(guān)指標觀察 ①血清睪酮水平：分別于分組處理第8、12、16周8:00，抽取兩組耳緣靜脈血3 mL，4 000 r/min離心5 min，分離血清，由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生化室采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清睪酮。②標本大體情況：分組處理第16周，采用空氣栓塞法處死，取出右股骨髁，肉眼觀察標本大體情況。③軟骨組織IGF-1表達：取右股骨髁標本，4%多聚甲醛固定24 h，15% EDTA脫鈣4周，脫水，石蠟包埋，5 μm厚度切片。常規(guī)免疫組化染色，以細胞核或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為陽性細胞，隨機選擇同組任意一只動物的左股骨髁標本作為對照。100倍顯微鏡下隨機選取10個視野，記錄陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算陽性細胞百分比，即軟骨組織IGF-1陽性表達率。④關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分：取右股骨髁標本，常規(guī)進行HE染色和Safranin-O染色，由2位觀察者分別于100倍顯微鏡下，參照Mankin′s評分標準[4]進行評分(Mankin′s評分越高說明病理分期越高，骨關(guān)節(jié)炎病情越嚴重)。

2 結(jié)果

2.1 血清睪酮水平 兩組第8周血清睪酮水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，觀察組第12、16周血清睪酮水平均明顯高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組血清睪酮水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 標本大體情況 對照組右膝關(guān)節(jié)明顯腫大，關(guān)節(jié)軟骨面變薄、粗糙，軟骨表面色澤變暗，潰瘍較深，邊緣骨贅形成明顯。觀察組右膝關(guān)節(jié)腫大程度輕于對照組，軟骨表面有光澤，可見小潰瘍和不規(guī)則裂隙。

2.3 軟骨組織IGF-1表達 兩組均有陽性顆粒表達，觀察組軟骨組織內(nèi)陽性細胞密集，軟骨層均見其表達，對照組軟骨全層表達較少。觀察組軟骨組織IGF-1陽性表達率為(62.31±4.26)%， 對照組為(3.58±0.66)%，兩組比較P<0.05。

2.4 關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分 觀察組關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分為(4.00±0.58)分，對照組為(9.67±0.99)分，兩組比較P<0.05。

3 討論

KOA的病理學(xué)基礎(chǔ)是軟骨基質(zhì)合成和降解失衡，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞[5]。正常關(guān)節(jié)軟骨90%以上由軟骨基質(zhì)組成，蛋白聚糖和Ⅱ型膠原是其主要成分，蛋白聚糖丟失[6]、降解可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨彈性降低或喪失、含水量降低，最終引起關(guān)節(jié)軟骨破壞和功能喪失[6，7]。人類膝關(guān)節(jié)軟骨細胞、關(guān)節(jié)滑膜組織及骨細胞中均存在雄激素受體[9]，且男性和女性的軟骨細胞均能表達二氫睪酮和睪酮受體，說明軟骨細胞可能受雄激素的調(diào)控[10]。睪酮能夠結(jié)合骨骼中的雄激素受體而影響骨骼的內(nèi)環(huán)境，同時關(guān)節(jié)軟骨細胞具有合成雄激素的能力，進一步說明雄激素可能與KOA的發(fā)病有關(guān)[11]。本研究觀察組第12、16周血清睪酮水平明顯高于對照組，且血清睪酮水平維持在正常生理劑量；與對照組比較，觀察組右膝關(guān)節(jié)腫大程度輕，軟骨表面具有光澤，潰瘍和裂縫較小。說明睪酮可促進KOA去勢雄兔的軟骨修復(fù)。

軟骨生長因子(如IGF-1、轉(zhuǎn)化生長因子等)能夠促進軟骨細胞的增殖、分化及誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨組織分化，維持軟骨結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。當軟骨受到破壞時，基質(zhì)蛋白溶解，激活的蛋白酶活化IGF-1，從而促進軟骨細胞增殖，維持環(huán)境穩(wěn)定。IGF-1還可通過細胞表面受體而發(fā)揮作用，在成人軟骨組織中IGF-1能促進軟骨細胞分裂增殖，并增強軟骨保護作用[12]。研究認為，睪酮能上調(diào)成熟軟骨細胞層IGF-1表達，促進軟骨生發(fā)層生長，其調(diào)節(jié)機制可能與IGF-1有關(guān)[1,13]。本研究觀察組軟骨組織IGF-1陽性表達率高于對照組；表明睪酮能夠上調(diào)軟骨組織中IGF-1的表達，并可能通過促進軟骨細胞的增殖而對關(guān)節(jié)軟骨發(fā)揮修復(fù)作用。國外研究發(fā)現(xiàn)，生理劑量的睪酮對男性晚期OA患者軟骨形成具有積極作用，在關(guān)節(jié)滑液中給予睪酮替代治療可刺激患者關(guān)節(jié)軟骨組織的再生潛能[14]。睪酮與關(guān)節(jié)軟骨中雄激素受體結(jié)合，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，二氫睪酮能夠減少網(wǎng)狀組織的破壞、減少膠原和糖胺聚糖丟失，但不能阻止彈性蛋白的丟失[15]。睪酮可作用于IGF-1，IGF-1通過其細胞表面受體發(fā)揮作用，促進蛋白多糖及Ⅱ型膠原的合成，利于軟骨修復(fù)，維持環(huán)境穩(wěn)定[16～19]。體外研究表明，在無IL-1存在的情況下，睪酮亦能刺激關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的合成，阻止軟骨基質(zhì)的丟失。本研究觀察組關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評分低于對照組，表明十一酸睪酮不但可以促進軟骨細胞的增殖，還可促進軟骨基質(zhì)的合成并抑制其降解。

綜上所述，睪酮可促進KOA去勢雄兔的軟骨修復(fù)；其機制可能與促進IGF-1表達有關(guān)。

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貴州省科技廳社發(fā)攻關(guān)基金資助項目(黔科合SY[2010]3091)；貴州省衛(wèi)生廳資助項目(D-285)；碩士啟動基金資助項目(院字[2013]20)。

劉毅(E-mail： 13308529536@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.010

R684

A

1002-266X(2017)16-0035-03

2016-04-05)